摘要：本應(yīng)用報(bào)告內(nèi)容： • 建立了三七分析的高分離度快速液相色譜(RRLC)方法 • 從常規(guī) HPLC 到 RRLC 的方法轉(zhuǎn)換結(jié)果 • RRLC 方法的使用縮短了分析時(shí)間，同時(shí)保持了復(fù)雜組分的良好分離度，從而提高 了樣品通量，降低了成本 • 采用優(yōu)化的方法得到了三七植物不同部位的色譜圖，結(jié)果顯示其峰形和特定皂甙的 濃度各不相同

前言 中藥（TCM）在中國(guó)已有很長(zhǎng)的歷史， 其療效被中國(guó)、韓國(guó)、日本等亞洲國(guó)家 廣泛認(rèn)可。西方國(guó)家也越來(lái)越普遍地將 中藥作為食品添加劑或營(yíng)養(yǎng)品。隨著時(shí) 間的推移，已有 11000 多種中藥曾被使 用。中藥的研究和質(zhì)量控制十分依賴于 儀器分離，并要求很高的分離性能。 在本研究中，我們建立了一種分析三七 的高分離度快速液相色譜(RRLC)方法。用 安捷倫的方法轉(zhuǎn)換器可以將常規(guī) HPLC 方法輕松轉(zhuǎn)移至 RRLC。用不同的提取方 法制備三七植物不同部位的樣品。將這 些樣品用優(yōu)化的方法進(jìn)行分離，得到的 色譜圖顯示其具有不同的色譜峰形。本 應(yīng)用報(bào)告還顯示了定量結(jié)果。質(zhì)量控制 部門可以利用本研究開發(fā)更快、更好的 方法，縮短分析時(shí)間、提高樣品通量。 使用該方法還降低了溶劑成本，改善了 整個(gè)分析流程。 三七，在中國(guó)也稱田七，是一種重要而 昂貴的中藥。已栽培了約 400 年，85% 以上的三七產(chǎn)自中國(guó)的云南省。三七的 療效主要有活血化瘀、消腫止痛。最新 的 藥 理 學(xué) 研 究 表 明 ， 三 七 （ Panax notoginseng）具有抗癌和保肝作用，對(duì) 心腦血管系統(tǒng)也有保護(hù)作用［1］。三七的 皂甙圖譜與著名的人參(Panax ginseng) 和西洋參(Panax quinquefolium)非常相 似，因?yàn)樗鼈儗儆谕环N屬。三七主要用 于中國(guó)南方，有多種不同的中藥劑型。著 名的中藥制劑云南白藥和片仔癀都含有 三七。 中藥基質(zhì)的復(fù)雜一直是質(zhì)量控制和研究 的最大挑戰(zhàn)。中國(guó)藥典 2005 版列出了藥 材三七和中國(guó)藥物三七傷藥片，必須 對(duì)制劑中的三七皂甙 R1 成分進(jìn)行分析。 三七皂甙的一般分析時(shí)間為 60 分鐘以上。 隨著對(duì)中藥的研究越來(lái)越深入，科學(xué)家們 認(rèn)為僅控制一兩種組分還不足以確定中 藥的質(zhì)量，需要開發(fā)分離更多組分的質(zhì)量 控制方法。分離像中藥這樣的復(fù)雜樣品比 分離合成藥物需要更多的時(shí)間。當(dāng)樣品通 量也納入考量范圍的時(shí)候，理想的解決方 案就是用更短的時(shí)間得到相似或更好的 性能。采用 RRLC 可以開發(fā)分析時(shí)間更短、 性能更好的方法。RRLC 方法還有節(jié)省時(shí) 間和溶劑的優(yōu)勢(shì)。對(duì)生產(chǎn)質(zhì)量控制來(lái)說(shuō)， 使用 RRLC 意味著新批次的產(chǎn)品可以比用 常規(guī) HPLC 方法更快出廠。

實(shí)驗(yàn)部分 儀器 用配置以下組件的 Agilent 1200 系列高 分離度快速液相色譜系統(tǒng)開發(fā) RRLC 方 法： Agilent 1200 系列 RRLC 系統(tǒng)包括： • 帶真空脫氣機(jī)的 Agilent 1200 系列 SL 型二元泵 • Agilent 1200 系 列 SL 型 高 效 自 動(dòng) 進(jìn) 樣器 • Agilent 1200 系列 SL 型柱溫箱 • Agilent 1200 系列 SL 型二極管陣列檢 測(cè)器，配備微量流通池（2 µL 體積，3 mm 光程） • Agilent 化學(xué)工作站 B.02.01 SR1 ，用于 數(shù)據(jù)采集和處理 • Agilent ZORBAX XDB C18 RRHT 色譜 柱，4.6 x 50 mm，1.8 µm 粒徑 用包含以下組件的標(biāo)準(zhǔn)配置 Agilent 1100 系列液相色譜儀進(jìn)行常規(guī) HPLC 對(duì)比 實(shí)驗(yàn)： • 帶脫氣機(jī)的 Agilent 1100 系列二元泵 • Agilent 1100 系列自動(dòng)進(jìn)樣器 • Agilent 1100 系列柱溫箱 • Agilent 1100 系列二極管陣列檢測(cè)器 • Agilent ZORBAX SB-C18 色 譜 柱 ， 4.6 x 50 mm，5 µm 粒徑

樣品和樣品制備 • 三七皂甙 R1、人參皂甙 Rg1 和人參皂 甙 Rb1 標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢 定所(NICPBP)。人參皂甙 Re 和人參皂 甙 Rc 標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó) Sigma-Aldrich 公司 • 三七莖和葉提取物 (NCLE)由用戶實(shí)驗(yàn) 室友情贈(zèng)送。莖和葉用 60%乙醇萃取， 溶劑蒸干后，用正丁醇溶解殘?jiān)?，再?溶劑蒸干，殘留黃色粉末用甲醇溶解， 進(jìn)樣 • 三七根提取物 (NRE)由用戶實(shí)驗(yàn)室友情 贈(zèng)送。原始組分用水提取，經(jīng)大孔濾膜 過(guò)濾后，蒸干。殘留白色粉末用甲醇溶 解，進(jìn)樣 • 三七購(gòu)自當(dāng)?shù)厮幉纳痰?。品牌為同仁堂?原料用水/甲醇 (30/70，v/v)提取，超聲 處理 30 分鐘，用 0.22 µm 濾膜過(guò)濾，用 澄明濾液進(jìn)樣 • 水、乙腈和甲醇均購(gòu)自美國(guó) Fisher 公司

方法轉(zhuǎn)換 使用 5 µm 粒徑填料色譜柱的常規(guī) HPLC 方法需要轉(zhuǎn)換為使用 1.8 µm 粒徑填料色 譜柱的 RRLC 方法。安捷倫的方法轉(zhuǎn)換器 （在 Agilent 1200 系列高分離度快速液相 色 譜 系 統(tǒng) 的 光 盤 上 ， 出 版 號(hào) 5989- 5130EN）可用于這一目的，轉(zhuǎn)換過(guò)程簡(jiǎn) 便、快速（圖 1）。根據(jù)不同情況，轉(zhuǎn)換 后的方法可能需要按方法轉(zhuǎn)換器上列出的 不同參數(shù)做進(jìn)一步調(diào)整。如何將常規(guī) HPLC 方法手動(dòng)轉(zhuǎn)換成 RRLC 方法，可查 閱安捷倫的其它應(yīng)用報(bào)告[2,3,4] 。

結(jié)果與討論 色譜圖 藥理研究結(jié)果表明，由于組分不同，三 七植物的不同部位有不同療效。為了獲 得更多有效的成分，我們采用了各種特 殊提取方法。三七樣品用常規(guī) HPLC 方 法和 RRLC 方法分析得到了不同的峰形圖。 圖 2 顯示了用常規(guī) HPLC 方法分析的三 七莖和葉提取物（NCLE）的色譜圖。通 常此類分離需要 60 分鐘以上[5] 。如實(shí)驗(yàn) 部分所述，分析三七樣品的 RRLC 方法是根據(jù)常規(guī) HPLC 方法開發(fā)的。同樣的 NCLE 樣品分別采用常規(guī) HPLC 方法和 RRLC 方法 1。色譜圖見圖 2 和圖 3。圖 3 的色譜峰比圖 2 的峰窄，這說(shuō)明提高了 復(fù)雜樣品的峰容量。RRLC 分析的分離度 或分離性能比常規(guī) HPLC 更好。同時(shí)分 析時(shí)間從 60 分鐘縮短到 20 分鐘。另一 個(gè)應(yīng)當(dāng)關(guān)注的因素是常規(guī) HPLC 和 RRLC 的色譜柱選擇性應(yīng)保持一致。如果新 RRLC 柱具有和常規(guī) HPLC 柱不同的 選擇性，轉(zhuǎn)換方法將失去意義。本研究中 的峰形和洗脫順序都相同，因而沒有必要 再確認(rèn)新色譜圖中的色譜峰。另外，二極 管陣列檢測(cè)器的 UV 光譜圖也有助于進(jìn)一 步確證。

圖 4 顯示了用 RRLC 方法 2 分析 NCLE 樣 品 所 得 的 色 譜 圖 。流 速 提 高 到 1.5 mL/min，縮短了分析時(shí)間。同時(shí)還保持 了與圖 3 結(jié)果相同或相當(dāng)?shù)男阅?。?duì)于 復(fù)雜樣品，縮短分析時(shí)間意味著損失峰容 量。因此，用戶應(yīng)權(quán)衡峰容量和分析時(shí)間 做出選擇。 如實(shí)驗(yàn)部分所述，三種樣品取自不同部位。 圖 5 為用 RRLC 方法 1 分析三七根提取 物（NRE）樣品的色譜圖。該樣品采用不 同的步驟從三七根中提取的。色譜峰形顯 示 NRE 和 RCLE 含有不同種類的皂甙和 其它成分。為了檢驗(yàn)我們建立的 RRLC 方 法能否用于其它三七樣品的分析，我們?cè)?當(dāng)?shù)刂兴幍曩?gòu)買了三七，品牌為同仁堂， 藥店已經(jīng)把這種三七制成了粉末。對(duì)該三 七樣品分析的色譜圖見圖 6 和圖 7。圖 6 中的色譜圖為采用 RRLC 方法 1 所得，圖 7 采用的是 RRLC 方法 3。與需要 60 分 鐘以上分析時(shí)間的常規(guī) HPLC 方法相比， 圖 7 中的色譜圖顯示 4 分鐘即可完成分 析。三七莖和葉提取物比所分析的其它樣 品更復(fù)雜，使用 RRLC 方法 1 或 2 在保 證分離度的同時(shí)節(jié)省了分析時(shí)間。對(duì)于像 同仁堂三七提取物這樣不太復(fù)雜的樣品， 可以用更快速方法在較短的時(shí)間內(nèi)完成分 析，如圖 7 所示。

定量結(jié)果 用 RRLC 方法 2 分析了實(shí)驗(yàn)部分列出的 標(biāo)準(zhǔn)品。采用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品建立校正 曲線，測(cè)定三個(gè)樣品的濃度。定量結(jié)果見 表 2。NCLE 含有許多種類的皂甙，但不 含 Rc 或 Re。NRE 含皂甙的種類較少， 但卻包含了本研究所分析的 5 種標(biāo)準(zhǔn)品。 同仁堂三七提取物不含多種皂甙，也不含 Rc 或 Re。R1、Rb1 和 Rg1 的含量高于 NCLE 和 NRE。所有樣品中三七 R1 的濃 度為 0.029 到 0.89 µg/µL。本研究中建立 的定量方法可用于對(duì)不同方法提取的三 七進(jìn)行質(zhì)量控制。

結(jié)論 中藥是復(fù)雜的天然產(chǎn)物，用常規(guī) HPLC 方法分析需要高性能的系統(tǒng)和較長(zhǎng)的分 析時(shí)間。本研究所建立的 RRLC 方法顯示 了如何在保持復(fù)雜組分良好分離度的同 時(shí)縮短分析時(shí)間。色譜圖顯示不同三七提 取物樣品有不同的色譜峰形。如果將應(yīng)用 需求考慮在內(nèi)，還可以采用更快流速的 RRLC 獲得更快速的分析方法。本研究中 所建立的定量方法可輕松用于三七產(chǎn)品 的質(zhì)量控制。采用 RRLC 方法保持或提高 了性能，同時(shí)大大縮短了分析時(shí)間，從而 增加了樣品通量、降低了成本。