摘要中藥里經(jīng)常有一些成分必須用 HPLC液相色譜儀 檢測，但缺乏生色團(tuán)，在紫外檢測下沒有信號。Agilent 1200 系列蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）可以檢測比流動相揮發(fā)性低的所有溶質(zhì)，因此是一種替代手段。在中國藥典 2005 版中，有幾種需要使用 ELSD 檢測的中藥成分，本應(yīng)用報告列舉了兩個例子——銀杏（Ginkgo biloba L）中的黃酮，以及黃芪中的黃芪甲苷。

 

前言蒸發(fā)光散射檢測器作為 HPLC 系統(tǒng)中對無 UV 吸收分析物的準(zhǔn)通用型檢測器，正得到越來越廣泛的應(yīng)用。特別是在草藥中，越來越多無 UV 吸收的化合物需要以非衍生化狀態(tài)進(jìn)行檢測。Agilent 1200 系列 HPLC 產(chǎn)品線中的一個新成員——蒸發(fā)光散射檢測器——將為這類應(yīng)用提供幫助。Agilent 1200 系列 ELSD 可以檢測比流動相揮發(fā)性低的所有溶質(zhì)。只有樣品形成的非揮發(fā)性顆粒才能產(chǎn)生信號。如果某些化合物沒有生色團(tuán)，其揮發(fā)性又比液相色譜溶劑低，ELSD 就可作為使用簡便、靈敏度高的優(yōu)良檢測器。梯度流動相也不干擾檢測。如果流動相在特定 UV波長下產(chǎn)生強(qiáng)吸收，則 ELSD 將是另一種替代手段，可以保持基線的穩(wěn)定，并產(chǎn)生強(qiáng)信號。ELSD 的工作原理包括三個主要的連續(xù)步驟：a) 用氮氣或空氣使色譜洗脫液霧化b) 在相對低的溫度下讓流動相蒸發(fā)c) 殘留顆粒（包括分析物分子）產(chǎn)生光散射圖 1 顯示了檢測的各個階段。

 

中藥的某些組分沒有生色團(tuán)，因此需要一種通用的檢測器進(jìn)行檢測。Agilent1200 系列 ELSD 與其它通用檢測器相比有明顯優(yōu)勢。質(zhì)譜（MS）較昂貴，而且需要經(jīng)過良好培訓(xùn)、具備相關(guān)知識的操作者。質(zhì)量控制部門的常規(guī)分析工作一般不用質(zhì)譜。示差折光檢測器能進(jìn)行通用的檢測，但只能用于等度分析，不適合分離復(fù)雜混合物。如果配置 UV 檢測器的系統(tǒng)串聯(lián)一臺 ELSD，將能同時檢測各類結(jié)構(gòu)的多種化合物（帶生色團(tuán)或不帶生色團(tuán)）

中國藥典 2005 版中，有幾種中藥成分需要用 ELSD 檢測。例如，銀杏中的黃酮和黃芪中的黃芪甲苷。銀杏（Ginkgo biloba L.）及其提取物不僅在中國非常有名，而且也在世界各地被廣泛用于治療心腦血管疾病。它的療效主要來源于與黃酮一起存在的銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯。質(zhì)量控制方法必須能夠測定銀杏及其制品中黃酮的含量。黃芪（Radix Astragali），是一種在中國廣泛使用的中藥。藥理實驗和臨床研究已證明，黃芪具有多種生物活性，被用于治療腎炎、糖尿病、高血壓等疾病。其有效成分之一，黃芪甲苷，不含生色團(tuán)，需要一種通用檢測器來測定其含量。本應(yīng)用報告中，我們探討了銀杏黃酮和黃芪甲苷的分離和定量分析。本報告還提供了使用 Agilent 1200 系列 ELSD 的一些建議。

 

實驗部分儀器開發(fā)高分離度快速液相色譜（RRLC）方法，使用配置如下的 Agilent 1200 系列RRLC 系統(tǒng)：• 帶脫氣機(jī)的 Agilent 1200 系列 SL 型二元泵• Agilent 1200 系 列 SL 型 高 效 自 動 進(jìn)樣器• Agilent 1200 系列 SL 型柱溫箱• Agilent 1200 系列 SL 型二極管陣列檢測器，配置微量流通池 (2 µL 體積，3 mm光程)• Agilent 1200 系列蒸發(fā)光散射檢測器，帶標(biāo)準(zhǔn)噴霧器• Agilent 化學(xué)工作站 B.03.02，用于數(shù)據(jù)采集和處理• Agilent ZORBAX XDB-C18 快速分離高通量 (RRHT) 色譜柱，3.0 x 50 mm，1.8 µm 粒徑

 

系統(tǒng)設(shè)置HPLC 組件按一般方式連接，如圖 2 所示。Agilent 1200 系列 ELSD 通過 RS-232 電纜與計算機(jī)相連。遙控電纜將 Agilent1200 系列 ELSD 與 HPLC 其它組件連接。系統(tǒng)測試實驗開始之前，應(yīng)對 Agilent 1200 系列ELSD 進(jìn)行測試，以確保其處于良好狀態(tài)，且性能合格。測試條件：• 樣品： 250 µg/mL（或相似濃度）• 溶劑： 等度，80% 水，20% 乙腈• 流速： 1 mL/min• 進(jìn)樣量： 20 µL• 色譜柱： Agilent ZORBAX EclipseXDB-C18，4.6 x 150 mm，5 µm (或其它相當(dāng)規(guī)格的色譜柱)• 柱溫箱 (TCC) 溫度：40 °C• ELSD 溫度：40 °C• ELSD 壓力：3.5 bar (51 psi)• ELSD 增益：7• ELSD 過濾器：1 秒• 一般系統(tǒng)：Agilent 1200 系列標(biāo)準(zhǔn)液相色 譜 系 統(tǒng) （請 注 意 ，需 要 進(jìn) 行 常 規(guī)HPLC 分 析 時 ，也 可 以 使 用 Agilent1200 系列 RRLC 系統(tǒng))方法運行后，若儀器安裝后處于良好狀態(tài)，應(yīng)記錄檢測器響應(yīng)值。以后每次需要的時候都應(yīng)該用同樣的方法進(jìn)行性能檢查。ELSD 不能使用不揮發(fā)的緩沖液。如果不揮發(fā)的鹽進(jìn)入 ELSD，檢測器將無法區(qū)分這些不揮發(fā)顆粒是來自樣品還是緩沖液。因而使基線明顯抬高，樣品的信噪比降低。由于 ELSD 只能檢測揮發(fā)性比流動相差的化合物，所以在開發(fā)新方法時，應(yīng)當(dāng)用另一種檢測器來確定所有化合物都可以從色譜柱中洗脫

標(biāo)準(zhǔn)品和樣品制備本實驗使用下列標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和溶劑：• 標(biāo)準(zhǔn)品購自 NICBP（中國藥品與生物制品檢定所）• 溶劑（甲醇、乙腈、四氫呋喃）均購自Thermo Fisher Scientific 公司• 水經(jīng) Millipore 純水系統(tǒng)制備• 黃芪樣品購自中藥店• 銀杏提取物由用戶饋贈樣品制備過程如下，稱取 1 克樣品，溶于5 mL 甲醇，超聲混合 30 分鐘，過濾，取澄明溶液進(jìn)樣。銀杏分析方法• 流動相： A = 水，B = 四氫呋喃/甲醇，體積比 10/25• 流速： 0.7 mL/min• 梯度： 0 分鐘，12% B；10 分鐘，16% B；15 分鐘，22% B；20 分鐘，30% B• ELSD： 溫度 = 40 °C，壓力 = 50 psi，增益 = 7，過濾器 = 3 秒黃芪分析方法• 流動相： A = 水，B = 乙腈• 流速： 0.7 mL/min• 梯度： 0 分鐘，20% B；1 分鐘，30% B；5 分鐘，35% B；30 分鐘，100% B• ELSD： 溫度 = 40 °C,壓力 = 50 psi，增益 = 5，過濾器 = 3 秒

結(jié)果與討論銀杏的分析銀杏及其制品的成分非常復(fù)雜，需要用HPLC 進(jìn)行良好分離。過去由于儀器的限制，常常采用等度方法。等度方法的缺點是分析時間長，分離度較差。本應(yīng)用報告采用梯度方法，在較短的時間內(nèi)獲得較好分離。圖 3 顯示的是銀杏黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，ELSD 和 UV 兩個通道信號的對比。黃酮在 210 nm 波長下有很低的響應(yīng)，254 nm沒有響應(yīng)。對 UV 和 ELSD 的靈敏度進(jìn)行比較說明了測定銀杏中黃酮時采用 ELSD是必要的。本方法還能通過查看 UV 補(bǔ)充信號辨別這些色譜峰中是否包含純的黃酮。圖 4 中的色譜圖顯示 ELSD 能夠檢測出銀杏樣品中的許多峰。該樣品成分非常復(fù)雜，ELSD 信息有助于找出更多組分，包括缺乏生色團(tuán)的成分。4 個黃酮峰彼此分離，并與其它組分分開。運行 ELSD 方法時，即使 ELSD 信號中已經(jīng)沒有色譜峰出現(xiàn)，還是要監(jiān)測 UV 通道，以確定所有組分都已從系統(tǒng)中洗脫出來，避免污染色譜柱和系統(tǒng)。