摘要有歷史記載以前，人們就已經(jīng)開始用草藥提取物治療疾病。同種植物常常因地域、氣候、生長條件或亞種不同，具有不同形式的活性成分。中藥（TCM）中使用的一些植物就是例子。人參作為其中的代表，其亞種廣泛分布在整個亞洲和美洲大陸。本應(yīng)用報告報導了用 Agilent 1200 系列高分離度快速液相色譜系統(tǒng)，配置快速分離高通量（RRHT）柱，對復雜人參提取物中的組分進行分離的方法。用 LC/ESI 八極加速飛行時間（oaTOF）和 LC/離子阱質(zhì)譜檢測并鑒別了地域或生物源性不同的人參所含化合物的差別?；谝阎慕M分結(jié)構(gòu)信息，通過測定組分譜圖可為人參制品的鑒定提供證據(jù)。

前言不同地域和文化的傳統(tǒng)天然療法，經(jīng)常使用同樣的植物制成草藥提取物和酊劑治療疾病。所用植物生長在不同條件下，表現(xiàn)為不同的亞種，其活性組分便有不同 。這 種 現(xiàn) 象 的 典 型 例 子 就 是 人 參(Panax spec.)，在中藥(TCM)中已經(jīng)使用了幾千年。在整個亞洲和美洲大陸，這種草藥有多種亞種分布[1]。人參這類復雜天然提取物的分析方法，是高效液相色譜(HPLC)[2]。其主要活性化合物為三萜皂甙，稱為人參皂甙，已分離并鑒定出了 80 多種。目前采用 LC/ESIoaTOF 精確質(zhì)量測定和 LC/離子阱或LC/三重四極桿儀，通過 MS/MS 和 MSn進行結(jié)構(gòu)解析，鑒別人參皂甙復雜而相似的結(jié)構(gòu)[3]，可以區(qū)分人參的不同產(chǎn)地或亞種，并通過藥物活性成分串聯(lián)質(zhì)譜分析所得到的碎片驗證藥用人參的質(zhì)量[4]。本應(yīng)用報告報導了用 Agilent 1200 系列高分離度快速液相色譜系統(tǒng)，配置快速分離高通量(RRHT)柱，分離人參(Panaxginseng)和西洋參(Panax quinquefolius)復 雜 提 取 物 成 分 的 方 法 。 用 LC/ESI oaTOF 精確質(zhì)量測定和 LC/離子阱MSn 質(zhì)譜進行檢測和鑒定，區(qū)分地域或生物源性的差異。根據(jù)已知的組分結(jié)構(gòu)信息，測定組分輪廓圖可以為人參制品鑒定提供證據(jù)。用 ESI oaTOF 進行精確質(zhì)量測量解析人參皂甙結(jié)構(gòu)，包括 CID 裂解和離子阱 MSn 分析已在本研究的第 I 和第 II 部分中詳細介紹[5,6]。

實驗部分儀器• 帶脫氣機的 Agilent 1200 系列 SL 型二元泵。該泵能夠用 1.8 µm 粒徑 RRHT 柱進行高分離 HPLC 分析，以獲得最佳分離性能• 帶溫度控制的 Agilent 1200 系列 SL 型高效自動進樣器(h-ALS SL)。該自動進樣器為配合 1200 系列 SL 型二元泵使用而特別設(shè)計，具有延遲體積• Agilent 1200 系列柱溫箱 (TCC)。該 TCC與 SL 型二元泵一起使用，在優(yōu)化的延遲體積條件下可選擇分離式熱交換器和柱后冷卻，并可選擇 2 位/10 通閥進行交替柱再生• Agilent 1200 系列 SL 型二極管陣列檢測器 (DAD)。該 DAD 能以高達 80 Hz 的采樣速率采集數(shù)據(jù)，并具有內(nèi)置數(shù)據(jù)存儲功能• Agilent 6210 MSD TOF。八極加速飛行時間質(zhì)譜儀，帶雙噴霧器接口以進行質(zhì)量校正，能以最高的準確性獲取分子質(zhì)量數(shù)。該飛行時間質(zhì)譜儀能以 40 Hz 速率采集數(shù)據(jù)，還能進行正/負切換• Agilent 6330 離子阱，用于 MSn 串聯(lián)質(zhì)譜實驗的離子阱質(zhì)譜儀，掃描速度高達每秒 26000 m/z，具有自動數(shù)據(jù)自適應(yīng)MSn 功能• LC/離子阱儀器控制軟件為化學工作站B01.03，離子阱軟件 5.3，用離子阱數(shù)據(jù)分析軟件 3.3 進行數(shù)據(jù)分析• LC/TOF 儀器控制采用 Mass Hunter 工作站進行數(shù)據(jù)采集，AnalystQS 進行數(shù)據(jù)分析• 色譜柱：ZORBAX SB-C18，2.1 x150 mm，1.8 µm

樣品1. 粉碎的凍干人參 (1 g) (Panax ginseng)和 粉 碎 的 凍 干 西 洋 參 (1 g) (Panaxquinquefolius) 分別加入 10 mL 甲醇，超聲處理 30 分鐘，過濾后直接分析2. 糖漿——如韓國人參提取物藥用制品(ILHWA Co., LTD, Korea) (1 g)溶解于100 mL 水/甲醇 (1/1，v/v)中，過濾后直接分析系統(tǒng)設(shè)置LC/MS 系統(tǒng)的設(shè)置如圖 1 所示。Agilent1200 系列 SL 型二元泵通過一根 0.17 mm內(nèi)徑不銹鋼毛細管與 Agilent 1200 系列h-ALS SL 連接。為減少延遲體積，h-ALSSL 的針座毛細管采用 0.12 mm 內(nèi)徑，用同樣規(guī)格的毛細管在柱溫箱中連接低延5989-5493EN 100遲體積(1.6µL)熱交換器，柱溫箱鏈接色譜柱。將 2 µL 流通池置于 SL 型 DAD 中用于 UV 檢測。出口毛細管直接連在 ESIoaTOF 或離子阱質(zhì)譜儀的電噴霧源噴霧器上。從人參（Panax ginseng）復雜天然產(chǎn)物提取物的 UV 分析可以看出，對儀器設(shè)置進行了優(yōu)化以獲得最高分離度[5]。使用 2.1 x 150 mm，1.8 µm 色譜柱，系統(tǒng)反壓一般在 560 bar 左右。UV 色譜圖中基線分離的色譜峰最大峰寬（FWHM）小于0.1 分鐘。高分離配置的 Agilent 1200 系列二元泵系統(tǒng)的全部性能在另一篇應(yīng)用報告中介紹[7]。只要稍加改動，這一系統(tǒng)也可以用于高通量分析[8]。

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方法• Agilent 1200 系列 SL 型二元泵的操作條件如下：溶劑 A： 水 + 0.1% TFA溶劑 B： 乙腈+ 0.1% TFA流速： 0.5 mL/min梯度： 0 分鐘 5% B1 分鐘 5 % B60 分鐘 85 % B61 分鐘 95 % B70 分鐘 95 % B停止時間： 70 分鐘后運行時間： 15 分鐘• 用 Agilent 1200 系列 SL 型高效自動進樣器進樣 10 µL 樣品，并將樣品冷卻到10 oC。1 分鐘后將樣品定量環(huán)切換到旁路，以降低延遲體積• Agilent 1200 系列柱溫箱，配備 1.6 µL低延遲體積熱交換器，設(shè)置為 50 oC• Agilent 1200 系列 SL 型二極管陣列檢測器，用 80 Hz 采集數(shù)據(jù)，檢測波長設(shè)置為 220 nm/4 nm，參比 360/100，采用2 µL 流通池，30 mm 光程• TOF 質(zhì)譜儀操作條件如下：離子源： ESI , 正離子模式，帶雙噴霧器，參考質(zhì)量干燥氣體： 12 L/min干燥溫度： 200 oC霧化器： 35 psi掃描： 200-1300碎裂電壓： 150 V 或 CID 300 V錐孔電壓： 60 V毛細管電壓： 3000 V• 離子阱質(zhì)譜儀的操作條件如下：離子源： ESI 正離子模式干燥氣體： 5.0 L/min干燥溫度： 300 oC霧化器： 15 psi靶標： 150000最大累加時間：100 ms掃描： 200-1300平均： 2MSn： 自動化MS/MS和MS3

結(jié)果與討論采用高分離度 HPLC 1.8 µm 粒徑色譜柱分 離 了 人 參 (Panax ginseng)和 西 洋 參(Panax quinquefolius)樣品中的各化合物，揭示了不同人參亞種粗提物中各成分的差異。很明顯，差異不僅在于人參皂甙的濃度不同，還在于各種屬中存在不同的化圖 1Agilent 1200 系列高分離度快速液相色譜系統(tǒng)與 MS 聯(lián)用，采用低延遲體積配置101 5989-5493EN合物。實驗證明，在離子阱 MS 基峰色譜圖（圖 2 和圖 3）中，20 到 40 分鐘之間洗 脫 的 主 要 組 分 為 常 見 的 人 參 皂 甙Re、Rg1、Rb1、Rb2、Rc 和 Rd，以及特殊的人參皂甙 Rf 和 F11。1.8 µm 粒徑色譜柱除了具有良好的分離度以外，其分離度還可以隨溫度改善。例如，在 50 °C 柱溫下，所有人參樣品中都含有的人參皂甙 Rem/z 946.5 [M+H]+ 和人參皂甙 Rg1 m/z823.5 [M+Na]+ 分不開（圖 2），但在 80 °C時卻能分離（圖 3）。要用 LC/MS 區(qū)分人參和西洋參，異構(gòu)體人參皂甙 Rf 和偽人參皂甙 F11 非常有用。對人參的分析顯示，質(zhì)子化和加合形式的人參皂甙 Rf 分別在 m/z 801.5 和 m/z 823.5 處。在 m/z801.5 處的異構(gòu)體偽人參皂甙 F11 只能作為痕量化合物檢測（圖 3）。相反，西洋參中卻含有大量偽人參皂甙 F11 ，而不含人參皂甙 Rf。