產(chǎn)品概述
T4 DNA Ligase催化雙鏈DNA或RNA上相鄰的5'-磷酸末端和3'-羥基末端形成磷酸二酯鍵。該酶不僅能夠催化平齊末端或粘性末端之間的連接，還可以修復(fù)雙鏈DNA、RNA或DNA/RNA 雜交雙鏈中的單鏈切刻。

產(chǎn)品組分
T4 DNA Ligase (Rapid) (2000 U/μl)

來源
克隆有來自T4噬菌體DNA Ligase基因的重組E. coli菌株。

保存條件
-30 ~ -15℃保存，≤0℃運(yùn)輸。

單位定義
1單位指在50 μl 1 × T4 DNA連接酶反應(yīng)緩沖液中，23℃反應(yīng)條件下，30分鐘能使50% 的經(jīng)HindⅢ消化的λDNA片段(100 ng)連接所需的酶量。

反應(yīng)緩沖液
2× Rapid Ligation Buffer
132 mM Tris-HCI pH 7.6 @ 25°C
20 mM MgCl2
2 mM DTT
2 mM ATP
15% PEG 6,000
10 × T4 DNA Ligase Buffer
500 mM Tris-HCI pH 7.6 @ 25°C
100 mM MgCl2
50 mM DTT
10 mM ATP

注意事項(xiàng)
1. 建議插入片段與載體的摩爾比應(yīng)在3:1 - 10:1。
2. 平末端載體與片段進(jìn)行連接時，應(yīng)首先將載體進(jìn)行去磷酸化處理，防止其自身環(huán)化。
3. dA-Tailing產(chǎn)物與DNA Adapter的摩爾濃度比在1:10 - 1:20。
4. T4 DNA Ligase不穩(wěn)定，使用時冰上操作，用完立即放回-20℃。

實(shí)驗(yàn)案例1: DNA片段和載體DNA的連接
1. 在微量離心管中配制如下連接反應(yīng)體系:

a. 插入片段與載體的摩爾比應(yīng)在3:1 - 10:1。
b. 平末端載體與片段進(jìn)行連接時，應(yīng)首先將載體進(jìn)行去磷酸化處理，防止其自身環(huán)化。

2. 16°C過夜反應(yīng)
3. 轉(zhuǎn)化
4. 將連接產(chǎn)物加入到100 μl感受態(tài)細(xì)胞中(連接產(chǎn)物的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的1/6)，輕輕彈勻，冰上孵育30 min。
5. 將離心管置于42°C水浴，不要晃動，準(zhǔn)確熱激90 sec后，立刻置于冰水浴中，靜置2 - 3 min。
6. 向離心管中加入900 μl LB或SOC培養(yǎng)基，150 rpm，37°C振蕩培養(yǎng)45 min，使菌體復(fù)蘇，抗性基因表達(dá)。
7. 5,000 rpm(2,500 × g)離心5 min，去掉900 μl上清。用剩余培養(yǎng)基將菌體重懸，用無菌涂布棒在含有正確抗性的平板上輕輕涂勻。室溫正置10 min。
8. 待菌液被平板吸收后，37°C倒置培養(yǎng)過夜。
▲如果使用超級感受態(tài)細(xì)胞(轉(zhuǎn)化效率>10⁸ cfu/μg)，可直接吸取100 - 200 μl孵育后的菌液涂板。剩余菌液可在4°C保存，一周之內(nèi)都可重新涂板。

實(shí)驗(yàn)案例2: DNA文庫構(gòu)建中接頭連接反應(yīng)
1. 在微量離心管中配制如下連接反應(yīng)體系:

用移液器輕輕吹打混勻
a. 產(chǎn)物為5'端磷酸化，3'端帶dA的DNA片段。
b. dA-Tailing產(chǎn)物與DNA Adapter的摩爾濃度比在1:10 - 1:20。

2. 在PCR儀中進(jìn)行連接反應(yīng):

反應(yīng)結(jié)束后，立即進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。

產(chǎn)品目錄

注：小包裝需加收干冰費(fèi)用