FluoresceinBiotin是一種放射性生物素的替代品，它可以通過(guò)熒光或吸光度來(lái)檢測(cè)和量化生物素結(jié)合Chemicalbook位點(diǎn)；一經(jīng)與抗生物素蛋白(avidin)或鏈霉親和素(streptavidin)結(jié)合，熒光或吸光度就淬滅。
5-FITC Biotin,CAS:134759-22-1 物理性質(zhì)：
英文名：5-FITC Biotin
英文名稱：Fluorescein biotin [5-((N-(5-(N-(6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)amino)pentyl)thioureidyl)fluorescein]
中文名：
5-FITC-生物素
熒光素-生物素
5-熒光素-生物素
5-熒光生物素
5-異硫氰酸熒光素-生物素
CAS號(hào)：134759-22-1
分子式：C42H50N6O8S2
分子量：831.02
純度：95%
外形：Orange Yellow Solid
熔點(diǎn) >164°C (dec.)
存儲(chǔ)條件：-20℃，陰涼，干燥，通風(fēng)良好的庫(kù)房
包裝規(guī)格：1g、5g、25g等
注意事項(xiàng)：取用時(shí)一定要干燥，避免頻繁解凍和冷凍。
溶解性：溶于大部分有機(jī)溶劑，溶于水
相關(guān)類別:熒光探針，標(biāo)記，顆粒和染色;熒光染料
供應(yīng)商：西安凱新生物科技有限公司
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相關(guān)介紹：
熒光素標(biāo)記的生物素(FITC-Biotin)操作步驟：
(一)獲得目的基因
1、通過(guò)PCR方法:以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板,按基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)),PCR循環(huán)獲得所需基因片段。
2、通過(guò)RT-PCR方法:用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA***鏈,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。
(二)構(gòu)建重組表達(dá)載體
1、熒光素標(biāo)記的生物素(FITC-Biotin)載體酶切:將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(同引物的酶切位點(diǎn))進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。
2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。
(三) 獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種
1、 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,根據(jù)重組載體的標(biāo)志(抗Amp或藍(lán)白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質(zhì)粒,雙酶切初步鑒定。
2、 測(cè)序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆,重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。
3、 以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。
(四)誘導(dǎo)表達(dá)
1、 熒光素標(biāo)記的生物素(FITC-Biotin)挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過(guò)夜培養(yǎng)。
2、按1∶50比例稀釋過(guò)夜菌,一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中, 37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大約需3hr)。
3、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對(duì)照組,余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實(shí)驗(yàn)組,兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。
4、分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉淀,用100μl 1%SDS重懸,混勻, 70℃10min。
5、離心12000g×1min,取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。
