產(chǎn)品名稱：致瀉性大腸埃希氏菌五重 PCR 試劑盒產(chǎn)品規(guī)格：50T/盒

產(chǎn)品貨號(hào)：KLP08-A0231

 

產(chǎn)品簡介：

大腸埃希氏菌是一類能引起人體以腹瀉癥狀為主的病原菌，常見的致瀉大腸埃希氏菌主要包括腸道集聚  性  大  腸  埃  希  氏  菌（  enteroaggregative Escherichia coli, EAEC  ）、 腸  道  致  病  性  大  腸  埃  希  氏  菌（enteropathogenic Escherichia coli， EPEC）、產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌(shiga  toxin-producing  Escherichia  coli,  STEC) (包括腸道出血性大腸埃希氏菌（enterohemorrhagic  Escherichia  coli，EHEC）)、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌（enterotoxigenic  Escherichia  coli，ETEC）、腸道侵襲性大腸埃希氏菌（enteroinvasive  Escherichia  coli,  EIEC）。該菌廣泛存在于自然界，當(dāng)其污染食品或水源后，可引起細(xì)菌性食物中毒或水源性腹瀉病爆發(fā)流行，所以致瀉大腸埃希氏菌的檢測(cè)對(duì)社會(huì)衛(wèi)生健康具有極da的意義。

為了滿足致瀉大腸埃希氏菌檢測(cè)及研究的需要，本公司根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)  GB4789.  6  合成了致瀉大腸埃希氏菌特征性基因特異性引物，并優(yōu)化形成本試劑盒。應(yīng)用本試劑盒進(jìn)行檢測(cè)具有快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確、操作簡單等特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)。

 

包裝規(guī)格及成分：

 

編號(hào)	成分	規(guī)格
試劑一	致瀉大腸埃希氏菌五重 PCR 反應(yīng)液	1 mL×1 管
試劑二	陽性對(duì)照	200 µL×1 管
試劑三	陰性對(duì)照	200 µL×1 管
使用說明書		1  份

 

運(yùn)輸及保存：低溫運(yùn)輸，-20℃保存。操作步驟：

一、樣本制備（參考  GB4789.  6）

固態(tài)或半固態(tài)樣品：固體或半固態(tài)樣品,以無菌操作稱取檢樣 25 g，加入裝有 225 mL  營養(yǎng)肉湯的均質(zhì)杯中，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以   8000  r/min~10000  r/min  均質(zhì) 1 min~2  min，或加入裝有  225  mL  營養(yǎng)肉湯的均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)  1  min~2

 

min  。

液態(tài)樣品：以無菌操作量取檢樣 25 mL，加入裝有 225  mL  營養(yǎng)肉湯的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)，振蕩混勻。

二、增菌

將 1 制備的樣品勻液于 36℃±1℃ 培養(yǎng) 6 h，取 10 μL ,接種于 30 mL 腸道菌增菌肉湯管內(nèi)，于 42℃±1℃培養(yǎng) 18 h 。

三、分離

將增菌液劃線接種 MAC 和 EMB 瓊脂平板，于 36 ℃±1 ℃ 培養(yǎng) 18 h~24 h ,觀察菌落特征。在  MAC   瓊脂平板上，分解乳糖的典型菌落為磚紅色至桃紅色，不分解乳糖的菌落為無色或淡粉色；在 EMB 瓊脂平板上，分解乳糖的典型菌落為中心紫黑色帶或不帶金屬光澤，不分解乳糖的菌落為無色或淡粉色，應(yīng)挑取乳糖發(fā)酵，以及乳糖不發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的菌落。

四、PCR  模板制備

• DNA 提取:使用 1 μL 接種環(huán)刮取營養(yǎng)瓊脂平板或斜面上培養(yǎng) 18 h~24 h 的菌落懸浮在 200  μL  0.  85%滅菌生理鹽水中，充分打散制成菌懸液，于  13000r  /  min  離心  3min，棄掉上清液。加入 1 mL  滅菌去離子水充分混勻菌體，于 100℃水浴或者金屬浴維持 10  min；冰浴冷卻后 13000  r  /  min  離心 3  min，收集上清液；按  1∶ 20 的比例用滅菌去離子水稀釋上清液，取 5 μL 作為 PCR 檢測(cè)的模板；可用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌 DNA，操作方法按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行。
• DNA 保存:所有處理后的 DNA 模板直接用于 PCR 反應(yīng)或暫存于 4 ℃  并當(dāng)天進(jìn)行PCR  反應(yīng)；否則，應(yīng)在-20  ℃  以下保存?zhèn)溆?1 周。也可用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌 DNA，操作方法按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行。

五、試劑準(zhǔn)備

• 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（在反應(yīng)混合液配制區(qū)進(jìn)行）：從試劑盒中取出 PCR 反應(yīng)液，解凍混勻，瞬離后向每個(gè) PCR 管中各分裝 20 μL PCR 反應(yīng)液，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。
• 加樣（在樣本處理區(qū)進(jìn)行）：在 PCR 反應(yīng)管內(nèi)加入 5 μL 制備的核酸樣本陽性對(duì)照或陰性對(duì)照，蓋上蓋子，輕彈混勻并瞬時(shí)離心后，立即轉(zhuǎn)移至檢測(cè)區(qū)進(jìn)行反應(yīng)。總反應(yīng)體系如下表。

試劑	添加量（25 μL）
致瀉大腸埃希氏菌五重 PCR 反應(yīng)液	20  μL
DNA 樣品/陽性對(duì)照/陰性對(duì)照	5  μL

 

六、PCR 檢測(cè)（在檢測(cè)區(qū)進(jìn)行） 請(qǐng)按照下表設(shè)置反應(yīng)程序：

階段	溫度設(shè)計(jì)			循環(huán)數(shù)
預(yù)變性	98℃	30	sec	1  ×
PCR 反 應(yīng)	98℃	15	sec	30  ×
	55℃	30	sec
	68℃	10	sec
反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物進(jìn)行  1.8%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后分析其條帶情況。

 

【結(jié)果判定方法】結(jié)果判定

1) 陰性對(duì)照：無目的基因條帶

2) 陽性對(duì)照：有目的基因 Stx1（244 bp）和 sth（171 bp）的明顯條帶。

致瀉大腸埃希氏菌類別	陽性基因名稱	片段長度（bp）
腸道聚集性大腸埃希氏菌（EAEC）	astA	102
腸道致病性大腸埃希氏菌（EPEC）	escV	544
產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌/腸道出血性大腸埃希 氏菌 （STEC / EHEC）	Stx1, escV+ Stx1	244 / 544+244
產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌（ETEC）	sth	647
腸道侵襲性大腸埃希氏菌（EIEC）	ipaH	171

 

注意事項(xiàng)

1. 開始檢測(cè)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本說明書，按要求操作。

2. 組織樣品的樣本處理和核酸擴(kuò)增應(yīng)注意生物安全

3. 試劑使用前，應(yīng)充分融化均勻后，瞬時(shí)離心；PCR 反應(yīng)管避免反復(fù)凍融。

4. 加樣時(shí)應(yīng)使樣品落入反應(yīng)液中，不應(yīng)有樣品黏附于管壁上，加樣后應(yīng)盡快壓緊管蓋。

5. 經(jīng)樣品前處理液處理過的樣本，不能用于樣本保存，僅用于即時(shí)檢測(cè)

6. 研磨組織樣本不宜過大，以防雜質(zhì)含量高而抑制后續(xù)的 PCR 反應(yīng)。

7. 樣品前處理液可置于 4℃保存。

8. 本產(chǎn)品只能用于科研實(shí)驗(yàn)，不能用于臨床診斷。