食品中膳食纖維測定用試劑盒GB/T 5009.88檢測方案

產(chǎn)品名稱：總膳食纖維試劑盒Total Dietary Fiber Assay Kit   產(chǎn)品編號：K-TDFR，規(guī)格：200次檢測

1. 簡介：

膳食纖維是指碳水化合物及其相類似物質(zhì)的總和，包括多糖、寡糖、木質(zhì)素以及相關(guān)的植物物質(zhì)。主要有纖維素、半纖維素、果膠及親水膠體物質(zhì)，如樹膠、海藻多糖等組分；另外還包括植物細(xì)胞壁中所含有的木質(zhì)素；不被人體消化酶所分解的物質(zhì)，如抗性淀粉、抗性糊精、抗性低聚糖、改性纖維素、黏質(zhì)、寡糖以及少量相關(guān)成分，如蠟紙、角質(zhì)、軟木脂等。

總膳食纖維檢測試劑盒是根據(jù)AOAC991.43，AOAC 985.29，AACC32-07和AACC 32-05方法開發(fā)的，也適用于其它方法，如AACC 
Method 32-21，AACC method32-06。

2. 檢測原理 

脫脂（如大于10%）干燥后的樣品經(jīng)熱穩(wěn)定a-淀FEN酶、蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶酶解消化，酶解液通過乙醇沉淀、過濾，乙醇和丙酮洗滌殘?jiān)蟾稍?、稱重，得到總膳食纖維（TDF）殘?jiān)?/p>

酶解液通過直接過濾、熱水洗滌殘?jiān)?，干燥后稱重，得到不溶性膳食纖維（IDF）殘?jiān)?/p>

濾液用乙醇沉淀，過濾、干燥、稱重，得到可溶性膳食纖維（SDF）殘?jiān)?/p>

TDF、IDF和SDF的殘?jiān)鄢鞍踪|(zhì)、灰分和空白即得TDF、IDF和SDF含量。

該檢測試劑盒的主要優(yōu)勢在于直接提供高純度的酶，酶的活力是標(biāo)準(zhǔn)化的，而標(biāo)準(zhǔn)化的a-淀FEN酶的活力在測量抗性淀粉是*的。淀粉葡萄糖苷酶中基本沒有纖維素酶，而其他常用的酶制劑中常含有這種污染物，這將導(dǎo)致溶解和低估β-葡聚糖。該試劑盒提供的酶都是穩(wěn)定的液體，可以保存到試劑盒有效期，并且是直接應(yīng)用液，不需要使用前再溶解。

3. 用途 

適用于檢測谷物、水果、蔬菜和加工食品中的總膳食纖維（TDF）、不溶性

膳食纖維（IDF）和可溶性膳食纖維（SDF）的檢測。

4. 提供試劑及材料 

每一個(gè)盒中的提供的酶試劑足夠進(jìn)行200個(gè)試驗(yàn)，如另外需要可單獨(dú)訂貨：

4.1熱穩(wěn)定a-淀粉酶

4.2蛋白酶

4.3淀粉葡萄糖苷酶

5. 需要的設(shè)備和試劑

5.1 設(shè)備

A. 高型無導(dǎo)流口燒杯：400mL或600mL

B. 坩堝：具粗面燒結(jié)玻璃板，孔徑40-60 
μm。清洗后在馬福爐中525℃灰化6小時(shí)或過夜，用真空泵除去硅藻土和灰分，室溫下用2%清洗液浸泡1小時(shí)，用水和蒸餾水沖洗干凈，用15 
mL丙酮沖洗后風(fēng)干，加1g硅藻土到干燥的坩堝中，在130℃干燥至恒重，在干燥器中冷卻1小時(shí)，記下坩堝（包括硅藻土）的重量。

C. 真空溶劑過濾裝置：真空泵或有調(diào)節(jié)裝置的抽吸器，1L的抽濾瓶，側(cè)壁有抽濾口，以及抽濾瓶配套的橡膠塞。用于酶解液的抽濾。

D. 恒溫振蕩水浴：95-100℃

E. 分析天平：感量0.1mg

F. 天平（臺秤）：4 000g量程，感量0.1g

G. 馬福爐：525±5°C，

H. 烘箱：103±2℃，130±3℃

I. 真空干燥箱

J. 干燥器：二氧化硅或等同干燥劑

K. PH計(jì)，具有溫度補(bǔ)償功能。

L. 微量凱氏定氮儀。

M. 移液器，50-200 μL，5 mL，一次性移液吸頭。

N. 計(jì)時(shí)器。

O. 橡膠刮勺

P. 磁力攪拌器

5.2 試劑

A. 95%乙醇（體積比），

B. 78 %乙醇：取821mL95%乙醇置于容量瓶中，用水稀釋到刻度，混勻。

C. 丙酮

D. 蒸餾水或去離子水

E. 清洗液Micro (International Products Corp.,Trenton,NJ).，配成2%液體

F. MES/TRIS緩沖液（0.05mol/L）:稱取19.52g (MES) (Sigma, M 8250)和14.2 g

(TRIS) (Sigma,T1503)，用1.7L蒸餾水溶解，用6mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至

8.2±0.1，加水稀釋到2L（注意24℃時(shí)PH值為8.2，20℃時(shí)PH值為8.3，27-28℃

時(shí)PH值為8.1）

G. 鹽酸溶液（0.561 mol/L）：取93.5mL 6 mol/L的鹽酸，加入700mL水中，混勻

后用水定容到1L。

H. 氫氧化鈉

I. PH值標(biāo)準(zhǔn)緩沖液：PH值為 4.0，7.0 和10.0。

6. 酶的純化和標(biāo)準(zhǔn)化

6.1 根據(jù)AACC/AOAC的膳食纖維檢測方法，必須確保酶的純度。

6.1.1 淀粉葡萄糖苷酶被木聚糖酶、纖維素酶和果膠酶污染，會(huì)低估β-葡聚糖、

阿拉伯木聚糖和果膠的含量。

6.1.2 熱穩(wěn)定a-淀粉酶被污染，會(huì)影響抗性淀粉的測量。

6.1.3 蛋白酶被4-β-葡聚糖酶污染，會(huì)低估β-葡聚糖的含量。

6.1.4 如不是使用該的酶，請參考下面方法測定。

注解：

『1』：沒有酶活力作用。

『2』：大酶活力作用

『3』：除很少量的柑橘果膠全部沉淀

『4』：含有大量抗性淀粉，準(zhǔn)確回收率的數(shù)值影響熱穩(wěn)定a-淀粉酶的使用量。

6.2 根據(jù)AACC/AOAC的膳食纖維檢測方法，必須對酶標(biāo)準(zhǔn)化測定，如果不是使用該的酶，請按以下方法測定

6.2.1 淀粉葡萄糖苷酶，0.2 mL，

--- 酶活力表示方法1：淀粉/葡萄糖酶-過氧化物酶法，3300 U/mL，1個(gè)酶活力單位定義為：40°C，PH值4.5時(shí)，每分鐘釋放1 
μmol葡萄糖所需要的酶量。

--- 酶活力表示方法2：對-硝基苯基-b-麥芽糖苷（PNPBM)法，200 U/mL， 
1個(gè)酶活力單位（1PNP單位））定義為：40°C，有過量萄糖苷酶存在下，每分鐘從對硝基苯基-β-麥芽糖苷釋放1 μmol 對硝基苯基所需要的酶量。

6.2.2 熱穩(wěn)定a-淀粉酶，0.05 mL，

--- 酶活力表示方法1：以淀粉為底物，以Nelson/Somogyi還原糖表示，10000U/mL 
，1個(gè)酶活力單位定義為：40°C，PH值6.5時(shí)，每分鐘釋放1 μmol葡萄糖所需要的酶量。

--- 酶活力表示方法2：對硝基苯基麥芽糖為底物，3,000 U/mL（Ceralpha），1個(gè)酶活力單位定義為：40°C，PH值6.5時(shí)，每分鐘釋放1 
μmol對-硝基苯基所需要的酶量。

6.2.3 蛋白酶，0.10 mL

--- 酶活力表示方法1：酪蛋白測試，350 U/mL或50 mg/mL或7 Tyrosine 
U/mL，1個(gè)酶活力單位定義為：40°C，PH值8.0時(shí)，每分鐘從可溶性酪蛋白中水解出（并溶于三氯yi酸）1 μmol酪氨酸所需要的酶量。

--- 酶活力表示方法2：偶氮酪蛋白測試，350 U/mL或50 mg/mL或7 Tyrosine 
U/mL，1個(gè)內(nèi)肽酶活力單位定義為：40°C，PH值8.0時(shí)，每分鐘從可溶性酪蛋白中水解出（并溶于三氯yi酸）1μmol酪氨酸所需要的酶量。該偶氮酪蛋白(貨號：S-AZCAS).

7. 檢測步驟

7.1 試樣制備

準(zhǔn)確稱取雙份試樣各1 g，質(zhì)量差小于0.005g，精確到0.1mg，置于400mL或600mL高型燒杯中，同時(shí)制備雙份空白樣，在每個(gè)燒杯中加入40 mL 
PH值8.2的MES-TRIS緩沖液，磁力攪拌，直到試樣*分散到緩沖液中。

7.2 熱穩(wěn)定a-淀粉酶酶解：加入50 
μL熱穩(wěn)定a-淀粉酶溶液，加蓋鋁箔，置于95-100°C恒溫振蕩水浴中持續(xù)振搖，當(dāng)所有燒杯全部放入水浴開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)35分鐘。

7.3 冷卻：將燒杯取出玲卻到60°C，除去鋁箔蓋，用刮勺將燒杯內(nèi)壁和底部的膠狀物刮下，用10 mL蒸餾水沖洗燒杯壁和刮勺。

7.4 蛋白酶酶解：在每個(gè)燒杯中各加入100 
μL蛋白酶溶液，加蓋鋁箔，置于60°C恒振蕩水浴中，當(dāng)燒杯內(nèi)溫度達(dá)到60°C開始計(jì)時(shí)，持續(xù)反應(yīng)30分鐘。

7.5 PH值調(diào)節(jié)：反應(yīng)30分鐘后，邊攪拌邊加入0.561 mol/L鹽酸，嚴(yán)格控制60°C，用 1mol/L氫氧化鈉溶液或 
1mol/L鹽酸溶液，控制PH值在4.5±0.2。

7.6 淀粉葡萄糖苷酶酶解：在上述溶液中邊攪拌邊加入200 
μL淀粉葡萄糖苷酶溶液，加蓋鋁箔，置于60°C恒溫振蕩水浴中，持續(xù)振搖，當(dāng)燒杯內(nèi)溫度達(dá)到60°C開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)30分鐘。

8. 測定

8.1 不溶性膳食纖維測定：

8.1.1 
過濾洗滌：試樣酶解液全部轉(zhuǎn)移到坩堝中過濾，殘?jiān)?0mL預(yù)熱到70°C的蒸餾水洗滌兩次，合并過濾液，轉(zhuǎn)移至另一600mL高腳燒杯中，備測可溶性膳食纖維。殘?jiān)謩e用10mL 
95%乙醇和丙酮洗滌兩次，抽濾去除洗滌液，將坩堝連同殘?jiān)?03°C烘干過夜，將坩堝置于干燥器中冷卻1小時(shí)，稱重（包括坩堝、膳食纖維殘?jiān)凸柙逋粒?，精確至0.1mg，減去坩堝和硅藻土的干重，計(jì)算殘?jiān)|(zhì)量。

8.1.2 
蛋白質(zhì)和灰分測定：稱完質(zhì)量的殘?jiān)凸柙逋恋幕旌衔铮环萦脛P氏定氮法，以N×6.25為換算系數(shù)，計(jì)算蛋白質(zhì)質(zhì)量。另一份在525°C灰化5小時(shí)，于干燥器中冷卻，精確稱量坩堝總量（精確至0.1mg）減去坩堝和硅藻土干重，計(jì)算灰分質(zhì)量。

8.2 可溶性膳食纖維測定

8.2.1 計(jì)算濾液體積：將不可溶性膳食纖維過濾后的濾液收集到600mL的高型燒杯中，通過燒杯+濾液總重扣除燒杯質(zhì)量的方法估算濾液的體積。

8.2.2 沉淀：將濾液加入4倍體積預(yù)熱60°C的95%乙醇，或取80g濾液加入320mL預(yù)熱60°C的95%乙醇室溫下沉淀1小時(shí)。

8.2.3 過濾：在干燥的坩堝中加入1g硅藻土，70°C真空干燥至恒重，記錄坩堝的質(zhì)量（精確到0.1mg）。用15mL 
78%乙醇將硅藻土潤濕，并用真空溶劑過濾裝置在抽真空條件下，使硅藻土平鋪于坩堝中。將樣品酶解液緩慢轉(zhuǎn)移至對應(yīng)的坩堝中，抽濾。用刮勺和78%乙醇將所有殘?jiān)D(zhuǎn)至坩堝中。

8.2.4 洗滌：分別用15mL 78%乙醇、15mL 
95%乙醇和15mL丙酮洗滌殘?jiān)鲀纱危闉V去除洗滌液后，將坩堝連同殘?jiān)?05°C烘干過夜。將坩堝置于干燥器中冷卻1小時(shí)，稱重（包括坩堝、膳食纖維殘?jiān)凸柙逋粒?，精確至0.1mg。減去坩堝和硅藻土的干重，計(jì)算殘?jiān)|(zhì)量。

8.2.5 
蛋白質(zhì)和灰分測定：稱完質(zhì)量的殘?jiān)凸柙逋恋幕旌衔?，一份用凱氏定氮法，以N×6.25為換算系數(shù)，計(jì)算蛋白質(zhì)質(zhì)量，另一份在525°C灰化5小時(shí)，于干燥器中冷卻，精確稱量坩堝總量（精確至0.1mg）減去坩堝和硅藻土干重，計(jì)算灰分質(zhì)量。

8.3 總膳食纖維檢測檢測

8.3.1 
沉淀：在每份試樣中加入預(yù)熱至60°C的95%乙醇225mL（預(yù)熱后的體積，如乙醇的溫度超過65°C，則加入228mL），乙醇與樣液體積比為4：1，取出燒杯，蓋上鋁箔，室溫下沉淀1小時(shí)。建議改為：稱量酶解液的質(zhì)量，用天平加入4倍質(zhì)量的預(yù)熱的60°C的95%乙醇，4°C冰箱中沉淀過夜。

8.3.2 過濾：在干燥的坩堝中加入1g硅藻土，70°C真空干燥至恒重，記錄坩堝的質(zhì)量（精確到0.1mg）。用15mL 
78%乙醇將硅藻土潤濕，并用真空溶劑過濾裝置在抽真空條件下，使硅藻土平鋪于坩堝中。將樣品酶解液緩慢轉(zhuǎn)移至對應(yīng)的坩堝中，抽濾。用刮勺和78%乙醇將所有殘?jiān)D(zhuǎn)至坩堝中。

8.3.3 洗滌：分別用15mL 78%乙醇、15mL 
95%乙醇和15mL丙酮洗滌殘?jiān)鲀纱?，抽濾去除洗滌液后，將坩堝連同殘?jiān)?05°C烘干過夜。將坩堝置于干燥器中冷卻1小時(shí)，稱重（包括坩堝、膳食纖維殘?jiān)凸柙逋粒_至0.1mg。減去坩堝和硅藻土的干重，計(jì)算殘?jiān)|(zhì)量。

8.3.4 蛋白質(zhì)和灰分測定：稱完質(zhì)量的殘?jiān)凸柙逋恋幕旌衔铮环萦脛P氏定氮

法，以N×6.25為換算系數(shù)，計(jì)算蛋白質(zhì)質(zhì)量。，另一份在525°C灰化5小時(shí)，

于干燥器中冷卻，精確稱量坩堝總量（精確至0.1mg）減去坩堝和硅藻土

干重，計(jì)算灰分質(zhì)量。

9. 計(jì)算：

DF（%）=『（R1+R2）/2-p-A-B』/『（M1+M2）/2』*100%式中：

DF=樣品中膳食纖維含量（TDF、IDF、SDF），%

R1 和R2=雙份樣品殘?jiān)馁|(zhì)量，單位為毫克（mg）

m1 和m2=雙份樣品的質(zhì)量，單位為毫克（mg）

A=灰分的質(zhì)量，

P=蛋白的質(zhì)量

B=空白=(BR1+BR2）/2-BP-BA

BR1 和BR2=雙份試樣空白殘?jiān)馁|(zhì)量

BP=試樣空白蛋白的質(zhì)量

BA=試樣空白灰分的質(zhì)量

可以使用該的計(jì)算軟件Mega-CalcTM進(jìn)行自動(dòng)計(jì)算。

方法二

根據(jù)AACC method 32-05 和AOAC Method 985.29方法測定

1. 儀器設(shè)備和同方法一

2. 試劑和溶液

a. 280±2.0 mL 95 %乙醇

b．10±0.5 mL 78 %乙醇

c. 50±0.5 mL緩沖液

d. 磷酸鹽緩沖液（0.08mol/L，PH值6.0）: 取1.400g Na2HPO4和9.68g NaH2PO4

溶解在700mL蒸餾水中，用水定容到1L，用PH計(jì)檢查PH值。

e. 氫氧化鈉溶液（0.275mol/L）：去11g氫氧化鈉溶解在700mL蒸餾水中，冷卻轉(zhuǎn)

移到容量瓶中，用水定容到1L。

f. 鹽酸溶液（0.325 mol/L）：取 325 mL 1.0 mol/L 鹽酸置于容量瓶中，用水定容

到1L。

3. 樣品準(zhǔn)備

總膳食纖維的測定必須是低脂或無脂的干燥樣品，取混勻后的樣品于70°C真

空干燥過夜，干燥器中冷卻，再稱重記錄重量損失，干樣粉碎后過0.3-0.5 mm

篩，若試樣不能加熱，則冷凍干燥后再粉碎過篩。如果是高脂肪樣品(> 10 %)，

取經(jīng)過干燥的樣品分別用25mL石油醚脫脂三次，干燥后記錄脫脂的質(zhì)量損失，

后計(jì)算總膳食纖維含量時(shí)進(jìn)行進(jìn)行校正，粉碎過篩后的干燥試樣放在干燥

器中待用。

4. 分析步驟

準(zhǔn)確稱取雙份試樣各1 g，質(zhì)量差小于0.005g，精確到0.1mg，置于400mL或

600mL高型燒杯中，同時(shí)制備雙份空白樣，在每個(gè)燒杯中加入50 mL PH值6.0

的磷酸鹽緩沖液，磁力攪拌，直到試樣*分散到緩沖液中，控制PH值6.0±0.1。

4.2 熱穩(wěn)定a-淀粉酶酶解：加入50 μL熱穩(wěn)定a-淀粉酶溶液，加蓋鋁箔，置于沸騰

水浴中15分鐘，每5分鐘輕輕振蕩一次。當(dāng)燒杯內(nèi)的溫度到100°C開始計(jì)時(shí)，

總共大約30分鐘。

4.3 冷卻：將燒杯取出冷卻到室溫，加入10 mL 0.275mol/L 的氫氧化鈉，調(diào)節(jié)

PH值在7.5±0.1。

4.4 蛋白酶酶解：在每個(gè)燒杯中各加入100 μL蛋白酶溶液，加蓋鋁箔，置于60°C

恒振蕩水浴中，當(dāng)燒杯溫度達(dá)到60°C開始計(jì)時(shí)，持續(xù)反應(yīng)30分鐘。

4.5 冷卻：加入10 mL 0.325 mol/L鹽酸，調(diào)節(jié)PH值在4.5±0.2。

4.6 淀粉葡萄糖苷酶酶解：在上述溶液中邊攪拌邊加入200 μL淀粉葡萄糖苷酶溶

液，加蓋鋁箔，置于60°C恒溫振蕩水浴中，持續(xù)振搖，當(dāng)燒杯內(nèi)溫度達(dá)到60°C

開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)20分鐘。

4.7 在每份試樣中加入預(yù)熱至60°C的95%乙醇280mL（預(yù)熱前的體積），乙醇與樣

液體積比為4：1，取出燒杯，蓋上鋁箔，室溫下沉淀1小時(shí)。

4.8 過濾：在干燥的坩堝中加入1g硅藻土，70°C真空干燥至恒重，記錄坩堝的質(zhì)

量（精確到0.1mg）。用15mL 78%乙醇將硅藻土潤濕，并用真空溶劑過濾裝置

在抽真空條件下，使硅藻土平鋪于坩堝中。將樣品酶解液緩慢轉(zhuǎn)移至對應(yīng)的

坩堝中，抽濾。用刮勺和78%乙醇將所有殘?jiān)D(zhuǎn)至坩堝中。

4.9 洗滌：分別用20mL 78%乙醇洗滌3次、10mL 95%乙醇和10mL丙酮洗滌殘?jiān)?/p>

各兩次，抽濾去除洗滌液后，將坩堝連同殘?jiān)?05°C烘干過夜或70°C真空

干燥過夜。將坩堝置于干燥器中冷卻1小時(shí)，稱重（包括坩堝、膳食纖維殘?jiān)?/p>

和硅藻土），精確至0.1mg。減去坩堝和硅藻土的干重，計(jì)算殘?jiān)|(zhì)量。

4.10 蛋白質(zhì)和灰分測定：稱完質(zhì)量的殘?jiān)凸柙逋恋幕旌衔?，一份用凱氏定

氮法，以N×6.25為換算系數(shù)，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。另一份在525°C灰化5小時(shí)，

于干燥器中冷卻，精確稱量坩堝總量（精確至0.1mg）減去坩堝和硅藻土干重，

計(jì)算灰分質(zhì)量。

計(jì)算：

未校正的平均空白殘?jiān)?(UABR)=平均試樣空白殘?jiān)|(zhì)量，單位為毫克

未校正空白蛋白殘?jiān)?BPR)=UABR x %空白蛋白/100

未校正空白灰分殘?jiān)?BAR)=UABR x %空白灰分/100

校正的空白(CB)= UABR - BPR - BAR

未校正的平均樣品殘?jiān)?(USAR)=平均試樣空白殘?jiān)|(zhì)量，單位為毫克

未校正樣品蛋白殘?jiān)?SPR)=UABR x %空白蛋白/100

未校正樣品灰分殘?jiān)?SAR)=UABR x %空白灰分/100

校正的樣品(CSR)= USAR-SPR-SAR-CB% TDF= 100 x CSR/樣品質(zhì)量mg終的% 
TDF是去除了和水分后的總膳食纖維含量。

10、參考文獻(xiàn)：

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Methods of Analysis, 14th ed., 1st suppl. Secs. 43, 
A14-43,A20, p.399.

2. Association of Official Analytical Chemists (1986). Changes in methods. 
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4. Prosky, L., Asp, N.-G., Furda, I., DeVries, J.W., Schweizer, T.F.and 
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5. Prosky, L., Asp, N.-G., Schweizer, T.F., DeVries, J.W. and Furda,I. 
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foods and food products. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 
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