T4 gene32蛋白在RPA中作用機(jī)制

T4 gene32蛋白來(lái)源于T4噬菌體，屬于單鏈DNA結(jié)合蛋白家族，是T4噬菌體的一種單鏈DNA結(jié)合蛋白，在RPA技術(shù)中發(fā)揮輔助作用。T4 gene32蛋白具有三個(gè)OB折疊結(jié)構(gòu)域，可識(shí)別并與單鏈DNA forma化學(xué)鍵結(jié)合，但與雙鏈DNA的結(jié)合力較弱。T4 gene32蛋白是RPA技術(shù)實(shí)現(xiàn)等溫?cái)U(kuò)增的一種輔助因子。它可保護(hù)單鏈DNA,促進(jìn)引物退火,并與其他關(guān)鍵酶協(xié)同作用，提高RPA反應(yīng)的效率與靈敏度，實(shí)現(xiàn)低豐度核酸的快速檢測(cè)。

規(guī)格參數(shù)：

RAA凍干顆粒產(chǎn)品：

HP80201 基礎(chǔ)型RAA核酸擴(kuò)增試劑（凍干顆粒）

HP80202 熒光型RAA 核酸擴(kuò)增試劑（凍干顆粒）

HP80203 基礎(chǔ)型RT-RAA核酸擴(kuò)增試劑（凍干顆粒）

HP80204 熒光型RT-RAA核酸擴(kuò)增試劑（凍干顆粒）

HP80205 試紙條型RAA核酸擴(kuò)增試劑（凍干顆粒）

HP80206 試紙條型RT-RAA核酸擴(kuò)增試劑（凍干顆粒）

RPA原料：

EH04401 DNA重組酶 Recombinase A

EH03201 Bst DNA聚合酶 Bst DNA polymerase

EH04801 核酸外切酶 IV Exonuclease IV

EH04701 核酸外切酶 III Exonuclease III

EH02501 M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶 M-MuLV Reverse Transcriptase

EH03301 Bsu DNA聚合酶大片段 Bsu DNA polymerase, Large Fragment

EH04501 重組肌酸激酶(CK) Creatine Kinase

EH03501 T4 UvsX重組酶 T4 UvsX Recombinase

EH03401 T4噬菌體基因32編碼蛋白(gp 32) T4 gene 32 Protein

EH03601 T4 UvsY蛋白 T4 UvsY Protein

HM0058 重組鼠源RNase抑制劑(40 U/µL) RNase Inhibitor

工作機(jī)理:

(1)保護(hù)單鏈DNA

在雙鏈DNA初變性后，T4 gene32蛋白可快速識(shí)別并且結(jié)合單鏈DNA，形成穩(wěn)定的蛋白-DNA復(fù)合體，以防止單鏈DNA的二次結(jié)構(gòu)形成和再次回環(huán)。這為后續(xù)的引物退火和延伸創(chuàng)造條件。

(2)促進(jìn)引物退火

T4 gene32蛋白可通過(guò)與單鏈DNA的非特異性結(jié)合穩(wěn)定其構(gòu)象，使引物更易于與模板退火，這有利于RPA反應(yīng)的啟動(dòng)。

(3)放置與替換

一旦引物-模板雙鏈體形成并進(jìn)展到延伸階段，T4 gene32蛋白被逐漸替換，以露出更多的單鏈DNA供聚合酶使用。這一替換過(guò)程需要消耗一定的能量。

(4)回收利用

在RPA反應(yīng)結(jié)束時(shí)，尚未結(jié)合的T4 gene32蛋白可被回收利用，這降低了RPA成本,有利于其商業(yè)化開(kāi)發(fā)。

作用機(jī)制:

T4 gene32蛋白主要通過(guò)兩種機(jī)制發(fā)揮作用:

(1)非特異性單鏈DNA結(jié)合

T4 gene32蛋白可快速識(shí)別和非特異性地結(jié)合單鏈DNA，以穩(wěn)定其構(gòu)象和防止回環(huán)。

(2)與其他蛋白的協(xié)同作用

T4 gene32蛋白還可與T4 UvsX Recombinase、T4 UvsY蛋白發(fā)生相互作用，協(xié)同地發(fā)揮作用，如促進(jìn)引物退火和加速替換等，提高RPA反應(yīng)的效率。

T4 gene32蛋白是RPA技術(shù)中主要應(yīng)用如下:

1. 提高RPA反應(yīng)效率

T4 gene32蛋白可保護(hù)單鏈DNA，促進(jìn)引物退火，并與其他關(guān)鍵酶協(xié)同作用，這可提高RPA反應(yīng)的效率和靈敏度，實(shí)現(xiàn)更高效的等溫?cái)U(kuò)增。

2. 商業(yè)RPA試劑盒

一些商業(yè)RPA試劑盒中的單鏈DNA結(jié)合蛋白成分包含T4 gene32蛋白，如TwistDx的Recombinase Polymerase Amplification kit等。這可提高試劑盒的性能和靈敏度。

3. 低豐度靶核酸檢測(cè)

T4 gene32蛋白的作用可提高RPA技術(shù)對(duì)低豐度DNA/RNA的檢測(cè)靈敏度，滿足某些樣本極低濃度下的檢測(cè)需求。

4. 實(shí)現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)檢測(cè)

T4 gene32蛋白保護(hù)的單鏈DNA更易于T4 UvsX Recombinase識(shí)別和結(jié)合，這有利于實(shí)現(xiàn)RPA對(duì)細(xì)胞核內(nèi)DNA和RNA的檢測(cè)。

5. 病原體低豐度快速檢測(cè)

聯(lián)合使用與特定病原體高度同源的引物，T4 gene32蛋白及RPA技術(shù)可實(shí)現(xiàn)病原體極低豐度的快速檢測(cè)，應(yīng)用于某些病原體感染的診斷，如病毒感染的診斷。

6. 微生物快速檢測(cè)

設(shè)計(jì)與特定微生物同源的引物，聯(lián)合T4 gene32蛋白及RPA技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)相關(guān)微生物DNA/RNA的快速檢測(cè)，滿足環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全等領(lǐng)域的需求。

7. miRNA快速檢測(cè)

利用與特定miRNA高度同源的引物，聯(lián)合T4 gene32蛋白及RPA技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞miRNA的快速靈敏檢測(cè)，滿足miRNA功能研究與開(kāi)發(fā)miRNA生物標(biāo)記物的需求。