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1.節(jié)苷脂的微量分離和純化方法 Stephan Ladisch ~ 兒童國家醫(yī)學中心癌癥和移植生物學中心主任，華盛頓特區(qū)2010這種溶劑分配方法允許從小樣品和節(jié)苷脂濃度低的樣品中分離節(jié)苷脂，特別是相對于潛在污染蛋白質和其他大分子量物種的濃度。該方法包括三個步驟: (1)制備干式總脂提取物; (2)在二異丙醚/1-丁醇/NaCl 水溶液中對總脂提取物進行分配; (3) Sephadex G-50凝膠排阻色譜法。最終的總節(jié)苷脂制劑被凍干并保存在干燥狀態(tài)。凍干細胞、血漿或組織的總脂提取物。干燥后的總脂提取物在 DIPE/1-丁醇/鹽水相和有機相之間的分配。Sephadex G-50凝膠過濾去除含節(jié)苷脂水相中的低分子污染物。1.總脂提取 1.總脂提取物: 氯甲醇方案: 1。將樣本(細胞、血漿、均質組織)放入適當大小的圓底玻璃管或燒瓶中凍干(即30倍組織或血漿體積)。2。用玻璃棒將凍干的樣品粉碎成細粉。加入氯仿: 甲醇(C: M)1:1。(20體積/克濕重組織或細胞，10體積/毫升血漿或血清)。用超聲波將固體分散在浴室超聲波儀中，用 N2和蓋子蓋緊橡皮布。(濕萃取，首先加入10卷。攪拌甲醇，然后10伏。氯仿)。3。第一次提取18小時。用磁力攪拌，在4 °C 下攪拌。4。每分鐘2000轉的離心管(750克，10分鐘).仔細傾倒全透明的上清液，不要轉移任何顆粒物質，并處理下面的每個(6)上清液。第二次提取用新鮮 C: M 1:1的額外原始體積重新提取總固體材料; 使用新鮮溶劑首先沖洗(4)中使用的離心管，然后將這些沖洗在原始提取燒瓶中。提取4小時。在4 °C 的 N2下攪拌，然后像(4)中那樣加工第二種提取物。

6.Rotovap (浴溫不高于20-25 °C)將(4)和(5)的組合上清液的體積減少到組合總體積的1/4。此時過夜冷卻至零下25攝氏度以沉淀蛋白質。像上面一樣再次離心，恢復透明上清液。定量地將這種濃縮的總脂提取物轉移到離心管(# 8142)中，在離心管中進行 DIPE/丁醇分離。保存顆粒直到后的 G-50階段，以防再加工是必要的。用一股 N2蒸發(fā)上清液至干燥，并用凍干法除去殘留的溶劑痕跡。注: 第一提取物去除了90% 以上的節(jié)苷脂，第二提取物中剩余的10% 與第一提取物沒有質的區(qū)別，冷卻至 -20 °C 時去除的沉淀物中不含節(jié)苷脂。使用的 C: M 的體積沒有被發(fā)現(xiàn)在一個合理的范圍內是關鍵的。我們已經(jīng)使用了多達10毫升/108細胞(即更高的體積) ，與通常的10-20體積相比，對回收率沒有影響。2.DIPE/1-丁醇/鹽水分隔

材料: 二異丙基醚1-丁醇，試劑級雙蒸餾去離子水(ddH2O)鹽水溶液: 0.1% NaCl 或0.3% NaCl15或50ml 玻璃錐形離心管，聚四氟乙烯內襯蓋(# 8142)方案: 階段: 有機: 2體積 DIPE/1-丁醇，60:40v/v 水: 1體積鹽水溶液。1% 氯化鈉: 每109個細胞的總脂提取物10毫升鹽水(最小體積為1毫升)。血漿: 對于血漿，使用 ddH2O: 2.0 ml ddH2O/總脂提取物1ml 血漿，最小水溶性容積為1ml。放射標記的細胞節(jié)苷脂: 1.0毫升最小體積的生理鹽水(使用少至106個細胞)。組織: 對于組織，使用0.3% NaCl: 109個細胞 = 1克組織，因此每克組織使用10毫升生理鹽水。注意: 以下程序步驟的細節(jié)是至關重要的，必須遵守。一旦開始步驟(1) ，則應立即執(zhí)行步驟(7)中的程序。在總脂提取物中加入有機(DIPE/1-丁醇)相，旋渦，超聲波直到樣品全分散。可能會產生乳白色的溶液，但是大顆粒必須在進入(2)之前被分散。加生理鹽水。3。執(zhí)行2分鐘。交替渦流與超聲波的結合。離心機10分鐘。轉速為2000轉(750xg)。5。從較低的水相中去除較高的有機相(與水相存在時，留下輕微的界面乳狀液)。添加新鮮有機相的原始體積，重復步驟(3)、(4)和(5)進行第二次分區(qū)。注: 隨后的節(jié)苷脂放射自顯影研究有兩個分區(qū)，需要最高定性純度的組織和血漿樣品最多有三個分區(qū)。7。通過用 N2流去除溶劑痕跡，冷凍和凍干，準備最終的水相(含節(jié)苷脂)用于下面的 STEP (3)。

3.Sephadex G-50凝膠過濾

材料：

葡聚糖凝膠G-50（150）

洗脫液：雙蒸餾去離子水（ddH2O）

紫外線監(jiān)測儀和記錄儀，在206nm處測量

協(xié)議：

將樣品重新溶解在適當體積的（ddH2O）中，短暫超聲以確保膠束形成，并加載有時著色但始終透明的水相。在空隙體積（峰1）中回收節(jié)苷脂，然后將其凍干并重新溶解在小體積的C:M 1:1中。離心樣品，在清澈上清液中定量回收神經(jīng)節(jié)甙脂。沉淀物含有在總脂質提取步驟中共提取的殘余蛋白質。

參考文獻：

（1） Ladisch，S.和Gillard，B.（1985）用于微規(guī)模節(jié)苷脂純化的溶劑分配方法。分析生物化學146:220-231。

（2） Ladisch，S.和Gillard，B.（1987）從血漿中分離和純化節(jié)苷脂?！睹笇W方法》138:300-306。

典型柱條件：

床體積流速（ML/MIN）最佳（最大）樣品裝載量裝載樣品的節(jié)苷脂總含量

10-15毫升0.25 0.3（0.7）5-20 80-100%

40毫升0.6 0.5（1.5）20-50 100%

90毫升1.2 1.5（3.0）70-5400 93-100%

 

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