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DCypherTM: 以高靈敏度和特異性詢問染色質(zhì)讀數(shù)器鑒定和評(píng)估讀數(shù)器與核小體結(jié)合的測(cè)定 epicypher產(chǎn)品測(cè)定 epicypher產(chǎn)品測(cè)定

概述: 詢問染色質(zhì)閱讀器表觀遺傳閱讀器蛋白因其在細(xì)胞功能中的重要作用以及靶向藥物開發(fā)治療癌癥等疾病的潛力而受到廣泛關(guān)注。經(jīng)典的方法依賴于組蛋白肽拉降序列來(lái)詢問染色質(zhì)閱讀器的結(jié)合偏好1。然而，這些方法由于低靈敏度和/或高背景而受到高失敗率的困擾。這對(duì)于解決低親和力相互作用特別有問題，因?yàn)殚喿x器蛋白在微摩爾范圍內(nèi)具有解離常數(shù)(Kd)是常見的。此外，線性肽不能概括在三維核小體結(jié)構(gòu)的背景下發(fā)生的體內(nèi)相互作用。為了解決這些問題，EpiCypher 已經(jīng)開發(fā)了一個(gè)敏感和強(qiáng)大的發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，以利用含有不同翻譯后修飾(PTM)的多種重組核小體來(lái)詢問染色質(zhì)閱讀器的結(jié)合，組蛋白變體，突變和/或 DNA 甲基化狀態(tài)。DCypher 染色質(zhì)讀取器測(cè)定: 測(cè)量生理學(xué)染色質(zhì)相互作用的同質(zhì)生化測(cè)定。該測(cè)定利用 Perkin Elmer 的 AlphaScreenTM 技術(shù)，能夠定量評(píng)估讀取器結(jié)構(gòu)域與核小體的相互作用(圖1A)。同質(zhì)的“混合和測(cè)量"性質(zhì)，沒有洗滌步驟，高靈敏度和穩(wěn)健的方法使其成為詢問低親和力染色質(zhì)讀者-核小體相互作用的理想選擇。HP1 something 是一個(gè)已建立的 H3K9甲基讀取子2，與單甲基、二甲基和三甲基結(jié)合(圖1B)。然而，當(dāng)呈現(xiàn) EpiCypher 設(shè)計(jì)者核小體(dNucs)時(shí)，HP1 something 僅對(duì) H3K9me3顯示顯著增強(qiáng)的特異性(圖1C)。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了在生物相關(guān)的核小體背景下研究表觀遺傳閱讀器相互作用的重要性。這里描述的協(xié)議允許終端用戶優(yōu)化 dCypher 染色質(zhì)閱讀器分析，首先使用 GSTtagedBRD4Bromodomain 1(BD-1)作為一個(gè)健壯的控制。然后，該方案可以容易地適應(yīng)各種感興趣的表觀遺傳閱讀器結(jié)構(gòu)域，不同的蛋白質(zhì)標(biāo)簽(例如 GST，His 或 FLAG) ，并且與 EpiCypher 不斷擴(kuò)大的物素化核小體組合兼容。此外，這種方法可以用來(lái)計(jì)算 Kd 表面積，以更準(zhǔn)確地比較相似的閱讀器和核小體結(jié)合對(duì)。圖1: 分析原理。用 dCypher 方法詢問染色質(zhì)閱讀器。(A)將物素化的核小體固定在鏈霉親和素供體珠上，并且通過抗標(biāo)簽綴合的 α 受體珠識(shí)別表位標(biāo)記的染色質(zhì)讀取器。供體的激光激發(fā)產(chǎn)生單線態(tài)氧，擴(kuò)散激活受體的發(fā)射。熒光計(jì)數(shù)與核小體-讀取器相互作用橋接的供體-受體數(shù)量成正比。(B) HP1 something (0.15 nM)與物素化組蛋白肽的結(jié)合。(C) HP1 something (1nM)與物素化核小體的結(jié)合。

DCypher: 以高靈敏度和特異性詢問染色質(zhì)讀數(shù)器鑒定和評(píng)估讀數(shù)器與核小體結(jié)合的測(cè)定

測(cè)定緩沖液120mM Hepes pH7.5,250mM NaCl，0.01% BSAadd 0.01% NP-40和1mM DTT 新鮮度測(cè)定緩沖液220mM Hepes pH7.5,250mM NaCl，0.01% BSA,添加0.01% NP-40新鮮標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議注意: 在加入每種試劑后簡(jiǎn)要地離心平板(≤800xg? 10秒)以最大限度地提高重現(xiàn)性 * 不要旋轉(zhuǎn)或超聲處理核小體溶液 * * 為了確定感興趣的讀取蛋白的最佳濃度，首先用已知的陽(yáng)性和陰性對(duì)照進(jìn)行滴定(例如圖2) * * * AlphaScreen 供體珠對(duì)光敏感，應(yīng)該在柔和的照明下處理。* * * * 當(dāng)使用鎳螯合受體珠時(shí)，建議使用10μg/mL SA 供體珠和2.5 μg/mL 受體珠。加入5μL 在測(cè)定緩沖液12中制備的4X 核小體 * (10nM 最終)。加入5μL 在測(cè)定緩沖液1 * * 3中制備的4X 染色質(zhì)讀數(shù)器。在 RT4孵化30分鐘。在 DARK * * * 準(zhǔn)備的測(cè)定緩沖液2 * * * * 5中加入10μL 2X 鏈霉親和素供體珠(5μg/mL)和谷胱甘受體珠(2.5 μg/mL)。在 RT6孵化60分鐘。閱讀使用阿爾法板讀取器: Ex680nm，Em 520-620nm

圖2: 蛋白質(zhì)滴定法。在測(cè)試核小體文庫(kù)之前，讀取器結(jié)構(gòu)域的最佳篩選濃度可以通過用已知靶核小體和陰性對(duì)照進(jìn)行滴定來(lái)確定。對(duì)于 BRD4 BD-1，評(píng)估結(jié)合未修飾(rNuc，EpiCypher # 16-0006)和四乙?；?/span>(H4K5,8,12,16 ac，EpiCypher # 16-0313)核小體。理想的濃度范圍是30-200nM，提供足夠的信號(hào)超過背景和下面的鉤點(diǎn)(點(diǎn)信號(hào)開始下降后飽和的檢測(cè)試劑)。問: 如果我感興趣的讀者領(lǐng)域沒有已知的目標(biāo)，或者如果我發(fā)現(xiàn)與組蛋白肽發(fā)現(xiàn)的已知的結(jié)合相互作用沒有在核小體上重現(xiàn)，我該怎么辦? 答: EpiCypher 科學(xué)家對(duì)不同類別的讀者領(lǐng)域和實(shí)驗(yàn)優(yōu)化有廣泛的經(jīng)驗(yàn)。請(qǐng)與我們聯(lián)系，建立一個(gè)科學(xué)！

圖3: BRD4 BD-1與 DCYPHER 核小體 K-ACYLSTAT 面板的結(jié)合。 EpiCypher 具有不斷擴(kuò)展的核小體文庫(kù)，具有單獨(dú)和組合修飾。使用100nM 蛋白質(zhì)評(píng)估 BRD4 BD-1與 dCypher K-AcylStat 面板的結(jié)合(參見圖2)。BRD4 BD-1對(duì) H4K5,8,12,16 ac 具有特異性，對(duì) H4上的個(gè)別乙酰修飾或 H3上的?；揎椌哂凶钚〉慕Y(jié)合。

用于染色質(zhì)重塑研究的全重組核小體底物

概述染色質(zhì)重塑，或核小體的重新定位，調(diào)節(jié) DNA 通路，從而基因表達(dá)和基因組修復(fù)。許多 ATP 依賴性重塑酶復(fù)合物與人類疾病有關(guān)，但由于對(duì)基于核小體的底物的需求，是具有挑戰(zhàn)性的研究目標(biāo)。EpiCypher 通過開發(fā)全重組重塑底物 EpiDyne 平臺(tái)來(lái)監(jiān)測(cè)核小體沿 DNA 的重新定位，從而滿足了這一需求。在這里，我們證明了 EpiDyne-FRET 在使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)讀數(shù)的均勻重構(gòu)分析中的應(yīng)用。

染色質(zhì)重塑作為治療目標(biāo)異常的核小體組織能夠嚴(yán)重破壞基因表達(dá)、 DNA 修復(fù)和細(xì)胞分化，并且在人類疾病中發(fā)揮重要作用，包括癌癥、炎癥、自身免疫、精神分裂癥、心血管疾病和智力障礙。值得注意的是，近20% 的癌癥都包含來(lái)自 SWI/SNF 家族的 ATP 依賴性染色質(zhì)重塑復(fù)合物的亞基突變。這些酶復(fù)合物通過“泵"組蛋白八聚體周圍的 DNA 來(lái)調(diào)節(jié)局部基因組的訪問，從而“滑動(dòng)"核小體[1]。在多種癌癥中觀察到 SWI/SNF 亞基的復(fù)發(fā)性體細(xì)胞突變，支持腫瘤發(fā)生的驅(qū)動(dòng)作用[2]。突變重塑蛋白是有吸引力的治療靶點(diǎn)，因?yàn)檫M(jìn)一步降低其 ATP 酶活性促進(jìn)癌細(xì)胞死亡，但節(jié)省正常細(xì)胞[2,3]。這種現(xiàn)象被稱為合成致死性，鑒定利用它的抑制劑可能導(dǎo)致具有癌癥特異性的藥物[4,5]。

染色質(zhì)重塑檢測(cè)使用重組單核小體底物埃皮塞弗已經(jīng)開發(fā)了表達(dá)式-熒光共聚染色質(zhì)重塑酶復(fù)合物來(lái)研究其功能。核小體由包裹在 ~ 147bp DNA 中的核心組蛋白八聚體組成，代表染色質(zhì)的基本重復(fù)單位。EpiDyne-FRET 由包裹在5’Cy3標(biāo)記的 DNA 中的末端定位的組蛋白八聚體(H2AT120C * Cy5)組成[8](圖1)。在其組裝的起始位置，Cy3-Cy5 FRET 最大，當(dāng)組蛋白八聚體重新定位(向模板 DNA 3’末端)或噴射時(shí)，通過 Cy5信號(hào)的丟失檢測(cè)到核小體重塑。圖1: EPIDYNE-FRET 核小體重塑底物由5’Cy3標(biāo)記的 DNA (217bp; 綠色球)包裹的 Cy5標(biāo)記的人組蛋白八聚體(H2A T120C-Cy5; 顯示為八聚體的紅色部分)組成，包括與核小體組裝難治性的 TGGA 重復(fù)區(qū)相鄰的末端核小體定位序列(147bp Widom 601[7])[8]。在組裝起始狀態(tài)下，Cy3-Cy5 FRET 達(dá)到最大值。當(dāng) Cy3標(biāo)記的 DNA 5’末端從 Cy5標(biāo)記的八聚體移開時(shí)，通過 FRET 信號(hào)的還原檢測(cè) ATP 依賴性重塑劑(例如 RSC 或另一種 SWI/SNF ATP 酶)的活性。EpiDyne-FRET 是一種與 HTS 應(yīng)用立即兼容的一步免洗方法。

測(cè)定所需的試劑和材料[見注(i)]•酵母 RSC [9](底物也與 dACF [ ACF-ISWI ] ，dNoRC [ Toutatis-ISWI ]和人 SMARCA2/4(BRG1/BRM)相容; 數(shù)據(jù)未顯示)• EpiDyne-FRET 核小體重塑底物(EpiCypher 目錄號(hào)16-4201)•測(cè)定緩沖液(20mM Tris pH 7.5,50mM KCl，3mM MgCl 2和0.1 mg/mL BSA (Sigma 目錄號(hào)。A3059)• ATP (Invitrogen 目錄號(hào)。PV3227)•可選: ATPγS (一種非水解形式的 ATP)• Corning 3820384孔測(cè)定板(Fisher Catalog No. 07-200-891)•用于384孔板的16通道多頻儀•384孔熒光微板讀數(shù)器能夠進(jìn)行 Cy3/Cy5-FRET 檢測(cè)(例如 Envision，Perkin Elmer)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議1。根據(jù)預(yù)期的時(shí)間點(diǎn)/重復(fù)(一式三份)確定所需的 RSC (10nM 最終) ，EpiDyne-FRET (20nM 最終)和 ATP (2mM 最終)的量[參見注釋(ii & iii)]。準(zhǔn)備反應(yīng)組分(室溫)。I. 2x 酶/底物溶液(20nM RSC + 40nMEpiDyne-FRET 底物在2x 測(cè)定緩沖液中)。2x ATP +/-抑制劑溶液(所需的 ddH2O + 抑制劑[例如 ATPγS ]中的4mM ATP)3。加入5μL 的2倍酶/底物溶液到微孔板上。4。通過加入5μL 的2xATP +/-抑制劑溶液來(lái)啟動(dòng)反應(yīng)。5。在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)，在384孔板讀取器中讀取，能夠檢測(cè)到 Cy3(激發(fā) -531nm/發(fā)射 -579nm)/Cy5(發(fā)射 -685nm)。數(shù)據(jù)表示為原始 Cy3和 Cy5發(fā)射信號(hào)在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的比值[8]。

注意事項(xiàng)(i)把蛋白樣本貯存在攝氏零下80度，并避免冷凍/解凍。(ii)對(duì)于測(cè)定開發(fā)，建議對(duì)多種反應(yīng)組分(包括酶、底物和 ATP)的濃度進(jìn)行滴定。(iii)由于數(shù)據(jù)表示為 Cy3-Cy5發(fā)射，因此重要的是不要在這些反應(yīng)中添加多余的底物。(iv)反應(yīng)可迅速開始。如果設(shè)置一個(gè)大板沒有一個(gè)自動(dòng)注射器有沒有一個(gè)能力的 T0為每個(gè)條件。2018年，NC。所有權(quán)利保留  由染色質(zhì)重塑復(fù)合物 NURF 介導(dǎo)的 ATP 依賴性組蛋白八聚體滑移。1999年的牢房。97(7) : p. 833-42.2.SMARCA2/4 ATP 酶結(jié)構(gòu)域在 SWI/SNF 突變型癌癥中超越 Bromodomain 作為藥物靶點(diǎn): 來(lái)自 cDNA 拯救和 PFI-3抑制劑研究的見解。巨蟹座，2015年。75(18) : p. 3865-78.3.針對(duì)染色質(zhì)重塑 BRG1增加了化藥物在乳腺癌細(xì)胞中的療效。腫瘤目標(biāo)，2016年。7(19) : p. 27158-75.4.Helming，K.C. ，X. Wang，and C.W. Roberts，突變 SWI/SNF 復(fù)合物在癌癥中的脆弱性。癌細(xì)胞，2014年。26(3) : p. 309-17.5.Karnezis，A.N. 等，SWI/SNF 復(fù)合物 ATP 酶 SMARCA4/BRG1和 SMARCA2/BRM 的雙重喪失對(duì)于卵巢高鈣血癥型小細(xì)胞癌是高度敏感和特異性的。JPathol 2016年。238(3) : p. 389-400.6.Clapier，C.R. ，等，染色質(zhì)重塑者 RSC/Sth1中 DNA 易位效率的調(diào)節(jié)增強(qiáng)核小體的滑動(dòng)和射出。Mol Cell，2016年。62(3) : p. 453-61.7.Lowary 和 J.Widom，高親和力結(jié)合組蛋白八聚體的新 DNA 序列規(guī)則和序列定向核小體定位。J Mol Biol 1998年。276(1) : p. 19-42.8.等人，TGGA 重復(fù)損害核小體的形成。J Mol Biol 1998年。281(2) : p. 253-60.

 

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