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培養(yǎng)成纖維細(xì)胞應(yīng)該使用什么培養(yǎng)基？有關(guān)單個細(xì)胞系的培養(yǎng)基的詳細(xì)信息，請參閱 目錄，在單個樣本詳細(xì)信息頁面的“培養(yǎng)協(xié)議"選項卡中。在使用之前，我們將 L- 氨酰胺(或等效物)加入到2mM 的最終濃度中。如果細(xì)胞培養(yǎng)基的長期儲存不成問題，可以使用含有氨酰胺(或等效物)的商業(yè)制備培養(yǎng)基?？评餇栄芯克皇褂每股鼗蚩拐婢幬?，因為在細(xì)胞儲存庫中存在隱性感染的危險。如果需要，研究人員可以添加抗生素。如果細(xì)胞培養(yǎng)比預(yù)期的要慢，我們的第一種方法是切換到另一批預(yù)先測試的血清和/或改變血清濃度5% 。生長緩慢的其他原因包括: 微生物污染，過于頻繁的繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)過低密度播種，細(xì)胞系衰老，培養(yǎng)基組成的變化，以及培養(yǎng)箱在調(diào)節(jié)溫度、濕度或 CO2方面的不足

如何處理新接收的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)？程序: 1。觀察細(xì)胞片的匯合情況，細(xì)胞形態(tài)和污染跡象。用消毒液擦拭培養(yǎng)瓶，放在37 °C 的培養(yǎng)箱中過夜，放下細(xì)胞片。不要移除培養(yǎng)基(只含有5% 的 FBS 以減緩運輸過程中的生長)。第二天，如上所述檢查燒瓶，根據(jù)培養(yǎng)物的匯合情況，要么通過取出運輸培養(yǎng)基并用約5ml 生長培養(yǎng)基覆蓋細(xì)胞來喂養(yǎng)燒瓶，要么根據(jù)下面概述的程序繼代培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)繼代培養(yǎng)一個新收到的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物時，必須確定正確的傳代數(shù)。如果提交表或瓶子上注明了通過號，繼代培養(yǎng)的瓶子應(yīng)該得到下一個連續(xù)的通過號。

成纖維細(xì)胞系是如何繼代培養(yǎng)的？供應(yīng)• HBSS 中的0.53 mM EDTA • HBSS 中的0.04% 蛋白酶/0.53 mM EDTA •成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基程序: 1。通過抽吸去除中間部分。2。使用試劑的適當(dāng)體積見表1。3。加入適量的 EDTA 溶液到燒瓶中，不要移動電池片，將燒瓶的電池面朝下放置。

4.通過倒置顯微鏡仔細(xì)觀察細(xì)胞長達(dá)10分鐘。如果細(xì)胞開始變圓或離開燒瓶，立即取出 EDTA 溶液。5。用 EDTA/蛋白酶溶液取代 EDTA 溶液。6。將燒瓶置于攝氏37度的環(huán)境下培養(yǎng)4至7分鐘。這些細(xì)胞會聚集起來，然后從燒瓶表面分離出來。7。擰緊瓶蓋，輕輕地敲打瓶子的側(cè)面，把剩余的細(xì)胞從瓶子里取出來。8。用顯微鏡檢查燒瓶，確保細(xì)胞全部分離。如果7分鐘后細(xì)胞沒有分離，再培養(yǎng)1到2分鐘。9。用生長培養(yǎng)基(停止培養(yǎng)基)清洗燒瓶的背面，使蛋白酶失活，然后輕輕地將細(xì)胞和培養(yǎng)基混合。10。刪除一個細(xì)胞計數(shù)等分試樣，并計數(shù)細(xì)胞。11。根據(jù)表2.12給燒瓶播種。將燒瓶放置在一個保溫箱中，保溫箱設(shè)置為適合單個細(xì)胞系的參數(shù)(通常為37 °C，5% CO2) ，如果沒有通風(fēng)，則松開瓶蓋。幾個小時后檢查培養(yǎng)物的細(xì)胞附著情況和 pH 值，繼代培養(yǎng)間隔的時間取決于細(xì)胞系。大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞系需要每5-7天進行一次亞培養(yǎng)。如果培養(yǎng)時間超過5天，每3-4天更換一次培養(yǎng)基。

成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物如何冷凍用于低溫儲存？用品• HBSS 中的0.53 mM EDTA • HBSS 中的0.04% 蛋白酶/0.53 mM EDTA •成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基•成纖維細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基(含10% 甘油或5% DMSO 的生長培養(yǎng)基)程序1。如果細(xì)胞在10% 的甘油中冷凍，完整的冷凍培養(yǎng)基可以保持在室溫下直到使用。以二甲基亞砜配制的冷凍介質(zhì)應(yīng)冷藏至使用為止。用顯微鏡檢查每個要冷凍(冷凍池)的燒瓶是否有污染和任何不尋常的生長模式。一個燒瓶應(yīng)該作為一個“備用"燒瓶，直到可以檢查冷凍的可行性。3。對于每個燒瓶，按照上面的子培養(yǎng)步驟1-9進行。4。轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸浮液從所有燒瓶和池細(xì)胞在離心機瓶坐在冰上。5.從冷凍池中取出一份等分試樣進行計數(shù)，計算細(xì)胞數(shù)并計算出冷凍池中存活的細(xì)胞總數(shù)。6。將冷凍池以60-100克的溫度在8-10 °C 下離心10分鐘。取出上清液，用溫和的研磨冷凍培養(yǎng)基以每毫升至少5 × 105個活細(xì)胞的最終濃度重新懸浮細(xì)胞團。將1毫升細(xì)胞懸浮液分裝到玻璃安瓿或塑料冷凍瓶中。9。使用氧丙烷火焰密封玻璃安瓿。檢查每個玻璃安瓿是否有在4 °C 浸泡在甲藍(lán)/乙醇中密封時形成的針孔或玻璃氣泡。10。將安瓿或冷凍瓶以每分鐘 -1攝氏度至 -80攝氏度的速度冷凍(在微處理器控制的冰箱中或被動地置于異丙醇浴中，在 -80攝氏度的冰箱中過夜)。將冷凍細(xì)胞儲存在液氮中。將玻璃安瓿浸入液體中，在氣相中儲存塑料冷凍瓶。

如何從低溫儲存中回收成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物？程序1。準(zhǔn)備適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基。從冷凍儲存的容器中取出一個安瓿或冷凍瓶，立即放入攝氏37度的水中，用力攪拌。3。一旦全解凍，用70% 的酒精海綿或同等消毒劑消毒安瓿或冷凍瓶。用銼刀劃破玻璃安瓿的頸部，然后用開瓶器打開。

4.使用無菌移液管移除安瓿或冷凍瓶中的內(nèi)容物，并將其放入含有5毫升適當(dāng)新鮮培養(yǎng)基的 T25組織培養(yǎng)瓶中。5。如果需要細(xì)胞計數(shù)，用1毫升移液管輕輕地混合瓶中的物質(zhì)，取出0.2毫升用1:5稀釋的細(xì)胞計數(shù)。將燒瓶放在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)箱中，細(xì)胞表面朝下。輕輕旋轉(zhuǎn)燒瓶，使細(xì)胞懸浮液均勻地分布在燒瓶表面。調(diào)整蓋子以允許適當(dāng)?shù)臍怏w交換(取決于介質(zhì)的緩沖系統(tǒng))。成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)在恢復(fù)后第二天用新鮮培養(yǎng)基重新喂養(yǎng)。如果通過清洗和離心去除所有的低溫保護劑，一些細(xì)胞系恢復(fù)得更好。將安瓿或冷凍液轉(zhuǎn)移到含有3-5毫升生長培養(yǎng)基的15毫升離心管中。在60-100xg 和8-10 °C 下離心5分鐘。除去上清液，重新懸浮顆粒，然后轉(zhuǎn)移到 T25燒瓶中，最終容量約為5毫升。如上所述，繼代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞所需的培養(yǎng)。如果1-2周后細(xì)胞無法增殖，擴大備用燒瓶進行第二次冷凍。