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toxin實驗報告與結(jié)果

閱讀:474          發(fā)布時間:2023-3-23

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因此,我們重點研究了 AT101誘導(dǎo)的 BNIP3 MPNST 細(xì)胞中的功能作用。為了確定 BNIP3是否促進(jìn) AT101誘導(dǎo)的 MPNST 細(xì)胞死亡,我們通過用 BNIP3siRNA 或?qū)φ辗前邢?span> siRNA 轉(zhuǎn)染 T265-2c 細(xì)胞來瞬時敲低 BNIP3表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn) BNIP3,而不是對照,siRNA 有效地減弱 BNIP3的表達(dá)(3D)。然后,我們用1015μMAT101處理 T265-2c 細(xì)胞,并比較 BNIP3siRNA 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的細(xì)胞活力與用對照寡核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的細(xì)胞活力。我們發(fā)現(xiàn),與用非靶向 siRNA 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比,在 BNIP3敲低的細(xì)胞中,AT101誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡顯著減弱(3E)。我們得出結(jié)論,BNIP3 AT101誘導(dǎo)的 MPNST 細(xì)胞毒性的重要介質(zhì)。 AT101引起 HIF-1α 蛋白的積累,其調(diào)節(jié) BNIP3表達(dá) BNIP3 HIF-1α 的直接轉(zhuǎn)錄靶標(biāo),已顯示調(diào)節(jié) BNIP3表達(dá)以響應(yīng)缺氧[40]和神經(jīng)酰胺處理的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞[41]。HIF-1α 可以在缺氧條件下和其他非缺氧刺激后積累[42]AT101或棉酚處理對 HIF-1α 蛋白水平的積累尚未見報道。因此,我們檢測了 AT101處理的 MPNST 細(xì)胞中 HIF-1α 的蛋白水平。我們發(fā)現(xiàn) AT101處理增加了 T265-2c 細(xì)胞中 HIF-1α 蛋白的水平(4A) ,而沒有伴隨的 HIF-1α mRNA 的增加(4B)。我們還發(fā)現(xiàn),在 AT101處理后,HIF-1α 蛋白在細(xì)胞核內(nèi)積累(4C) ,在那里它被證明具有轉(zhuǎn)錄因子的功能。來確定是否

BNIP3 HIF-1α 的直接轉(zhuǎn)錄靶標(biāo),已顯示其調(diào)節(jié)缺氧反應(yīng)中的 BNIP3表達(dá)[40]和用神經(jīng)酰胺處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞[41]。HIF-1α 可以在缺氧條件下和其他非缺氧刺激后積累[42]。AT101或棉酚處理對 HIF-1α 蛋白水平的積累尚未見報道。因此,我們檢測了 AT101處理的 MPNST 細(xì)胞中 HIF-1α 的蛋白水平。我們發(fā)現(xiàn) AT101處理增加了 T265-2c 細(xì)胞中 HIF-1α 蛋白的水平(4A) ,而沒有伴隨的 HIF-1α mRNA 的增加(4B)。我們還發(fā)現(xiàn),在 AT101處理后,HIF-1α 蛋白在細(xì)胞核內(nèi)積累(4C) ,在那里它被證明具有轉(zhuǎn)錄因子的功能。為了確定 HIF-1α 是否轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) BNIP3表達(dá),我們瞬時敲低了 T265-2c 細(xì)胞中的 HIF-1α 表達(dá)(4D) ,并檢查了 AT101處理后對 BNIP3表達(dá)的影響。我們發(fā)現(xiàn) HIF-1αsiRNA 而不是對照 siRNA 抑制 AT101處理的細(xì)胞中 BNIP3的表達(dá)(4E)。我們的結(jié)論是,AT101導(dǎo)致 HIF-1α 蛋白在 MPNST 細(xì)胞中的積累,從而促進(jìn) BNIP3的表達(dá)。

4。AT101通過 HIF-1α 積累刺激 BNIP3表達(dá)。用 AT101處理的 T265-2c 細(xì)胞(10μM,24小時)表現(xiàn)出 HIF-1α 蛋白水平增加(A) ,但是 AT101處理的 MPNST 細(xì)胞相對于未處理的細(xì)胞不顯示 HIF-1αmRNA 水平(B)的顯著變化。AT101導(dǎo)致 T265-2c 細(xì)胞核部分 HIF-1α 蛋白水平升高(C)。相對于用非靶 siRNA 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,用 AT101處理后,用 HIF-1αsiRNA 轉(zhuǎn)染的 T265-2c 細(xì)胞顯示 HIF-1α 蛋白(D) BNIP3蛋白表達(dá)(E)的水平降低。# = 不重要。

AT101通過細(xì)胞內(nèi)鐵螯合作用引起 HIF-1α 的積累除了缺氧之外,某些非缺氧刺激如雌激素、胰島素和表皮生長因子[43]-[45]可以在常氧條件下誘導(dǎo) HIF-1α 的表達(dá)。有趣的是,槲皮素和高良姜素等多酚也可以誘導(dǎo) HIF-1α 蛋白的積累,而不增加 HIF1-α mRNA 水平[46] ,正如我們在 AT101中觀察到的。這種作用被認(rèn)為是通過細(xì)胞內(nèi)鐵螯合作用介導(dǎo)的[46] [47]。因此,我們接下來詢問鐵是否參與 AT101誘導(dǎo)的 HIF-1α 積累,BNIP3表達(dá)和 MPNST 細(xì)胞死亡。為了解決 AT101是否干擾細(xì)胞內(nèi)鐵水平,我們評估了用 AT101處理的 MPNST 細(xì)胞中運鐵蛋白受器1(TfR1)和鐵蛋白(重鏈)的蛋白質(zhì)水平。TfR1是一種載體蛋白,促進(jìn)鐵轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞[48]TfR1的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄后受到調(diào)控,并與細(xì)胞內(nèi)鐵濃度呈負(fù)相關(guān)。此外,鐵蛋白重鏈催化細(xì)胞內(nèi)鐵儲存的第一步,其蛋白質(zhì)水平對應(yīng)于細(xì)胞內(nèi)鐵水平[48]。我們發(fā)現(xiàn) AT101處理增加了 T265-2c 90-8細(xì)胞中的 TfR1蛋白水平并降低了鐵蛋白重鏈蛋白水平,并且當(dāng)培養(yǎng)基補充檸檬酸鐵(100μM)作為鐵離子的來源時,這些 AT101效應(yīng)被阻斷(5A)。為了確定鐵螯合是否是 AT101誘導(dǎo) HIF-1α 積累以及隨后的 BNIP3和自噬的機制,我們評估了補鐵對這些事件的影響。在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入檸檬酸鐵消除了由 AT101誘導(dǎo)的 HIF-1α,BNIP3 LC3II 的積累(5B)。為了進(jìn)一步評估補鐵對 AT101誘導(dǎo)的 MPNST 細(xì)胞毒性的功能相關(guān)性,我們評估了添加檸檬酸鐵后的細(xì)胞活力。

我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)基的鐵補充對 T265-2c 90-8細(xì)胞中 AT101誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性提供了顯著的保護(hù)(5CD)。AT101 MPNST 細(xì)胞的這些作用與 DFO (一種著名的鐵螯合劑)的作用相似。向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加檸檬酸鐵不能影響 ABT737的細(xì)胞毒作用,ABT737 T265-2c 90-8細(xì)胞上結(jié)構(gòu)上不同的 BH3模擬物(5E,F)。

5。補鐵保護(hù) MPNST 細(xì)胞免受 AT101誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。 AT101(15μM24小時)處理增加了 MPNST 細(xì)胞中的運鐵蛋白受器1(TfR1)蛋白水平并降低了鐵蛋白水平(A) ,這通過向培養(yǎng)基中加入檸檬酸鐵逆轉(zhuǎn)。補充檸檬酸鐵(100μM)的培養(yǎng)基也消除了在 T265-2c 90-8細(xì)胞(CD) AT101誘導(dǎo)的 HIF-1α,BNIP3 LC3II 蛋白表達(dá)(B)和細(xì)胞毒性。通過用檸檬酸鐵(100μM)(E,F)補充培養(yǎng)基,MPNST 細(xì)胞不能從 ABT737(15μM)誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性中拯救。DFO (50μM,24小時)作為鐵螯合陽性對照。* p-value < 0.05.# = 不重要。

討論 AT101是棉酚的修飾對映體,一種天然存在的抗凋亡 BCL-2蛋白的小分子拮抗劑[49] [50]。AT101及其母體化合物棉酚已被證明在廣泛的癌細(xì)胞中具有細(xì)胞毒性作用,AT101目前正在進(jìn)行幾種癌癥的 II 期臨床試驗[51]-[54]。除了通過計算機輔助分子建模,核磁共振成像和熒光偏振測定被鑒定為 BH3模擬物外,其他研究已經(jīng)證明棉酚可以抑制 DNA 合成[19] ,細(xì)胞能量代謝[55] ,蛋白激酶C [21] ,端粒酶[57]和人類有絲分裂驅(qū)動蛋白,EG5[58]。除了這些作用之外,棉酚還可以調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)[20] TGF-β1信號傳導(dǎo)[59]。在結(jié)構(gòu)研究表明棉酚是一種 BH3模擬物后,發(fā)現(xiàn)棉酚可以通過增加活性氧類,激活 p53[61]和抑制 NF-κB 活性來激活內(nèi)在的凋亡途徑[62]。此外,棉酚可以增加促凋亡 BH3-only 蛋白的表達(dá)[23] ,并誘導(dǎo) BCL-2中的構(gòu)象改變,使其促凋亡[63]。由于棉酚細(xì)胞毒作用的機制可能受到癌細(xì)胞和其他腫瘤特異性因素的遺傳特征的影響,鑒定 AT101細(xì)胞毒作用的相關(guān)機制對于評估其在 MPNST 治療中的潛在用途是重要的。

 

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