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抗原蛋白 P9 ; 間接 ELISA

1 材料與方法

1. 1 菌株及血清 副雞禽桿菌 A、B、C 三個(gè)血清型

的標(biāo)準(zhǔn)株由本實(shí)驗(yàn)室保存。Apg 的 A 型菌、B 型菌

和 C 型單因子雞血清和 P9 蛋白抗血清分別由對(duì)應(yīng)

菌株或抗原人工接種 SPF 雞制得， 由本實(shí)驗(yàn)室制備

并保存。大腸桿菌 O1、O2、O78亞型以及流感( AI)

H9 亞型、新城疫( ND) LaSota 株( NDLa) 和 F48 株

( NDf48) 、雞傳染性法氏囊病 ( IBD) 、減蛋綜合征

( EDS'76) 等禽病病原單因子陽(yáng)性雞血清及 SPF 雞

血清等， 均由本實(shí)驗(yàn)室保存或制備， 支原體抗 MG-S6

株陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。120 份臨床

樣本血清采自河北某蛋雞場(chǎng) 120 日齡雞， 該雞群分

別在 56 日齡和 90 日齡用雞傳染性鼻炎三價(jià)滅活疫

苗進(jìn)行了免疫。

紅細(xì)胞凝集反應(yīng)用抗原( HA 抗原) : 副雞禽桿

菌 A 型( Hp8 株) 、B 型( BJ 株) 和 C 型( 668 株) HA

抗原， HA 效價(jià)均為 1∶ 160; 副雞禽桿菌 A 型陽(yáng)性血

清、B 型陽(yáng)性血清和 C 型陽(yáng)性血清， 紅細(xì)胞凝集抑

制( HI) 抗體價(jià)為 1∶ 80 ～ 1∶ 160; 10% 戊二醛固定的

雞醛化紅細(xì)胞， 以及血清稀釋液( 含 0. 1% BSA 的

0. 01 mol /L pH 值 7. 0 PBS) ， 以上材料均由本實(shí)驗(yàn)

室制備并保存。

1. 2 主要試劑和儀器 酶標(biāo)板為 NUNC 公司產(chǎn)

品， HＲP 標(biāo)記兔抗雞 IgG 抗體產(chǎn)自 Sigma 公司; TMB

顯色液產(chǎn)自 KPL 公司; 酶標(biāo)儀( Molecular Devices，

SPECTＲA MAX190) 。

1. 3 方法

1. 3. 1 抗原蛋白 P9 的制備及純化 利用生物信息

學(xué)軟件 Geneious( Biomatters. Ltd，

， 通 過(guò) 對(duì) 副 雞 禽 桿 菌 外 膜 蛋 白

HMTp210 的基因( GenBank No． KJ867497) 篩選分

析， 選取氨基酸序列從第 1090 到 1648 的肽段， 命名

為 P9， 由華大基因科技( 北京) 服務(wù)有限公司進(jìn)行全

基因合成并原核表達(dá)。通過(guò)對(duì) P9 編碼基因的 PCＲ

擴(kuò)增、與表達(dá)載體 pET30a 連接等步驟構(gòu)建重組表

達(dá) 質(zhì) 粒 pET30a-P9。 將 pET30a-P9 轉(zhuǎn) 化 BL21

( DE3) ， 誘導(dǎo)表達(dá)后超聲裂解上清用鎳親和層析柱

純化， 獲得純化的 P9 蛋白。

1. 3. 2 陰性血清及 P9 蛋白抗血清的制備 重組抗

原蛋白 P9 與 MONTANIDE ISA 71 VG 佐劑( SEPPIC

公司產(chǎn)品) 按 3 ∶ 7 重 量 比 混 合 乳 化 ( 操作方法見(jiàn)

SEPPIC 公司產(chǎn)品使用方法介紹) ， 使疫苗中抗原蛋

白終濃度為 20 μg /mL， 所制備的疫苗命名為 vP9。

免疫方法: 取 42 日齡 SPF 雞， 分為 2 組， 30 只 /組。

其中一組為疫苗免疫組， 分別胸部注射所述 vP9 疫

苗 0. 5 mL /只; 另一組為非免疫對(duì)照組。第 1 次免

疫后間隔 4 周， 對(duì)所有免疫組的雞進(jìn)行二次免疫， 劑

量及免疫途徑與次免疫相同。所有試驗(yàn)雞每周

于翅靜脈采血 1 次， 分離血清， － 20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3. 3 間接 ELISA 方法的建立

1. 3. 3. 1 抗原包被濃度及血清稀釋度的選擇 采

用棋盤(pán)滴定法， 用 0. 05 mol /L 碳酸鹽緩沖液( PBS，

pH 值 9. 6) 依次按以下比例稀釋 P9 抗原( 0. 5 mg /

mL) : 依次做 50、100、500、1 000、2 000、4 000、8 000、

16 000 倍稀釋?zhuān)?包被反應(yīng)板 100 μL /孔， 橫向包被酶

標(biāo)板， 4 ℃ 過(guò)夜; PBST ( PBS + 1% tween20， pH 值

7. 4) 清洗 3 遍后加入封閉液 ( 5% 脫脂乳， PBS 配

制) ， 37 ℃ 封閉 2 h， PBST 清洗 3 遍。陽(yáng)性血清及陰

性血清 分 別 用 稀 釋 液 ( 1% 脫脂乳， PBS 配制) 從

1∶ 50 進(jìn)行倍比稀釋( 1∶ 50 ～ 1∶ 400) ， 100 μL /孔， 縱

向加入封閉后的抗原包被板中， 其余試驗(yàn)步驟均按

ELISA 方法進(jìn)行， 試驗(yàn)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)副雞禽桿菌陽(yáng)性血

清值 OD450 nm值為 1. 0 左右， 陰性 OD450 nm值設(shè)為 0. 1

左右的范圍選擇 P /N 值最大為最佳稀釋條件。

1. 3. 3. 2 最佳血清抗體孵育時(shí)間篩選 將血清用

稀釋液稀釋至相應(yīng)濃度后加入抗原包被板， 100 μL /

孔， 分別 37 ℃ 孵育 0. 5 h、1 h、2 h， 其余試驗(yàn)步驟均

按 ELISA 方法進(jìn)行， 試驗(yàn)結(jié)果選擇 P /N 值最大為最

佳孵育時(shí)間。

1. 3. 3. 3 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度及時(shí)間確定 完

成血清孵育并清洗后， 以稀釋液分別稀釋 HＲP 標(biāo)記

兔抗雞 IgG 抗體至 1 ∶ 5 000、1 ∶ 10 000、1 ∶ 20 000，

100 μL /孔， 分別 37 ℃ 孵育 0. 5 h、1 h， 其余試驗(yàn)步

驟均按 ELISA 方法進(jìn)行， 試驗(yàn)結(jié)果選擇 P /N 值最大

為最佳條件。

1. 3. 3. 4 顯色時(shí)間確定 酶標(biāo)二抗孵育結(jié)束并清

洗后， 加入 TMB 顯色液， 100 μL /孔， 放置于 37 ℃ 孵

育 5、10、15、20 min 后加入 2 mol /L H2 SO4 終止讀

數(shù)， 50 μL /孔。選擇 P /N 值最大時(shí)最佳顯色時(shí)間。

1. 3. 4 臨界值的確定 在優(yōu)化間接 ELISA 的最佳

條件后， 使用該方法對(duì) 30 份陰性血清進(jìn)行檢測(cè)， 根

據(jù)檢測(cè)樣品的 OD450 nm 值平均值和標(biāo)準(zhǔn)差設(shè)定該間

接 ELISA 方法的判定值: !X + 3 s; 待檢樣品 的

OD

450 nm值若大于判定值， 則該樣品為陽(yáng)性， 反之， 則

判為陰性。

1. 3. 5 交叉反應(yīng)性試驗(yàn) 采用標(biāo)記為 Hp8( A 型) 、

0221( A 型) 、0083( A 型) 、0222( B 型) 、BJ( B 型) 、

668( C 型) 、Modesto( C 型) 等不同血清型副雞禽桿

菌分別單獨(dú)感染的雞血清作為待測(cè)陽(yáng)性血清， 未經(jīng)

免疫的 SPF 雞血清為陰性血清， 各個(gè)血清樣本做 3

個(gè)平行重復(fù)測(cè)試， 用于評(píng)價(jià)本方法的交叉反應(yīng)性。

1. 3. 6 特異性檢驗(yàn) 應(yīng)用已建立的間接 ELISA 方

法， 對(duì)常見(jiàn)的大腸桿菌 O1、O2、O78 株， 流感( AI)

H9 亞型、新城疫 ( ND) LaSota 株 ( NDla) 和 F48 株

( NDf48) 、減蛋綜合征( EDS'76) 、雞毒支原體 MG-S6

等禽病病原的陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)， 并以標(biāo)準(zhǔn)副雞禽

桿菌陽(yáng)性血清為陽(yáng)性對(duì)照， 測(cè)定 OD450 nm 值， 各個(gè)血

清樣本做 3 個(gè)平行重復(fù)測(cè)試， 確定該方法的特異性。

1. 3. 7 ELISA 方法檢測(cè)田間血清樣品 本試驗(yàn)建

立的 ELISA 方法， 對(duì)所收集的臨床免疫雞血清， 進(jìn)

行測(cè)定。各個(gè)血清樣本做 3 個(gè)平行重復(fù)， 計(jì)算 OD

值， 并依照本試驗(yàn)所設(shè)標(biāo)準(zhǔn)判定檢測(cè)結(jié)果。

1. 3. 8 ELISA 方法與 HI 試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)室收集的 120

份臨床樣品用 HI 試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)， 分別用 3 個(gè)血

清型的 HA 抗原進(jìn)行檢測(cè)， 方法如下［7］ : 用血清稀釋

液將吸附后的血清作 2 倍系列稀釋?zhuān)?第 1 孔為 1∶ 5，

第 2 孔為 1∶ 10， 依此類(lèi)推， 共作 8 個(gè)稀釋度( 1∶ 5，

1∶ 10， 1∶ 20， …， 1∶ 640) ， 每孔含有 50 μL 稀釋血清。

在各管中加入 4 個(gè) HA 單位的 HA 抗原 50 μL， 充分

混勻后在室溫作用 20 min， 然后每管加入 1% 雞紅細(xì)

胞 50 μL， 充分混勻后在室溫靜置 60 min， 判定結(jié)

果， 以全抑制 HA 的血清最高稀釋度為血清的 HI

效價(jià)。若試驗(yàn)血清的 HI 效價(jià)≥5， 即判為陽(yáng)性。

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