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VectorBuilder矢量輔助線(xiàn)

VectorBuilder整合了數(shù)十年實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)和發(fā)表的研究成果中的矢量學(xué)知識(shí)，為我們提供矢量指南。在這里，你可以了解更多關(guān)于基因傳遞各個(gè)方面的生物學(xué)、歷史、機(jī)制和應(yīng)用。我們?cè)谶@里是為了確保您擁有優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所需的一切。

 

規(guī)則質(zhì)粒基因表達(dá)載體

概述

 通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)染將質(zhì)粒載體遞送到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是生物醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用廣泛的程序之一。盡管多年來(lái)已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多更復(fù)雜的基因遞送載體系統(tǒng)，如慢病毒載體、腺病毒載體、AAV載體和piggyBac，但傳統(tǒng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染仍然是許多實(shí)驗(yàn)室基因遞送的主力。這在很大程度上是由于其技術(shù)簡(jiǎn)單以及在廣泛的電池類(lèi)型中具有良好的效率。用常規(guī)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染的一個(gè)關(guān)鍵特征是它是短暫的，只有極低比例的細(xì)胞將質(zhì)粒穩(wěn)定整合在基因組中（通常小于1%）。

 

關(guān)于這個(gè)矢量系統(tǒng)的更多信息，請(qǐng)參閱下面的論文。

參考文獻(xiàn)主題

摩爾生物技術(shù)。16:151（2000）哺乳動(dòng)物基因表達(dá)載體設(shè)計(jì)綜述

EMBO J.12:2539（1993）轉(zhuǎn)錄阻斷劑防止轉(zhuǎn)錄干擾

 

 

集錦

我們的載體經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可在大腸桿菌中進(jìn)行高拷貝數(shù)復(fù)制和高效轉(zhuǎn)染。用載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以基于用戶(hù)選擇的標(biāo)記基因表達(dá)來(lái)選擇和/或可視化。

 

優(yōu)勢(shì)

 

技術(shù)簡(jiǎn)單性：通過(guò)傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染將質(zhì)粒載體輸送到細(xì)胞中在技術(shù)上是簡(jiǎn)單的，并且比需要包裝活病毒的基于病毒的載體容易得多。

 

非常大的貨物空間：我們的載體可以容納約30kb的總DNA。質(zhì)粒骨架僅占約3kb，留下足夠的空間來(lái)容納用戶(hù)感興趣的序列。

 

高水平表達(dá)：質(zhì)粒的常規(guī)轉(zhuǎn)染通常會(huì)在細(xì)胞中產(chǎn)生非常高的拷貝數(shù)（每個(gè)細(xì)胞高達(dá)數(shù)千個(gè)拷貝）。這可以導(dǎo)致載體上攜帶的基因具有非常高的表達(dá)水平。

 

缺點(diǎn)

 

載體DNA的不整合：質(zhì)粒載體的常規(guī)轉(zhuǎn)染也被稱(chēng)為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，因?yàn)檩d體在沒(méi)有整合的細(xì)胞中主要停留為游離體DNA。然而，質(zhì)粒DNA可以以非常低的頻率（根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型，每102至106個(gè)細(xì)胞中就有一個(gè)）久整合到宿主基因組中。如果將耐藥性或熒光標(biāo)記物摻入質(zhì)粒中，則可以在延長(zhǎng)培養(yǎng)后通過(guò)藥物選擇或細(xì)胞分選獲得穩(wěn)定整合質(zhì)粒的細(xì)胞。

 

有限的細(xì)胞類(lèi)型范圍：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的效率因細(xì)胞類(lèi)型而異。非分裂細(xì)胞通常比分裂細(xì)胞更難轉(zhuǎn)染，原代細(xì)胞通常比永生化細(xì)胞系更難轉(zhuǎn)染。周知，一些重要的細(xì)胞類(lèi)型，如神經(jīng)元和胰腺β細(xì)胞，很難轉(zhuǎn)染。此外，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染在很大程度上僅限于體外應(yīng)用，很少在體內(nèi)使用。

 

基因遞送的不均勻性：盡管成功轉(zhuǎn)染會(huì)導(dǎo)致每個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒載體的平均拷貝數(shù)非常高，但這可能是高度不均勻的。一些細(xì)胞可以攜帶許多拷貝，而另一些細(xì)胞攜帶的拷貝很少或根本沒(méi)有。這與基于病毒的載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)不同，后者往往導(dǎo)致相對(duì)均勻的基因遞送到細(xì)胞中。

關(guān)鍵組件

啟動(dòng)子：驅(qū)動(dòng)你感興趣的基因的啟動(dòng)子就放在這里。

 

Kozak：Kozak一致序列。它被放在感興趣的ORF的起始密碼子前面，因?yàn)樗徽J(rèn)為有助于真核生物中的翻譯起始。

 

ORF：你感興趣的基因的開(kāi)放閱讀框架放在這里。

 

SV40晚期pA:Smian病毒40晚期多腺苷酸化信號(hào)。它促進(jìn)上游ORF的轉(zhuǎn)錄終止。

 

巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子：人類(lèi)巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子。它驅(qū)動(dòng)下游標(biāo)記基因的普遍表達(dá)。

 

標(biāo)記：藥物選擇基因（如霉素耐藥性）、視覺(jué)可檢測(cè)基因（如EGFP）或雙報(bào)告基因（如EGFP/Neo）。這允許用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞被選擇和/或可視化。

 

BGH pA：牛生長(zhǎng)激素多腺苷酸化。它促進(jìn)上游ORF的轉(zhuǎn)錄終止。

 

pUC ori：復(fù)制的pUC起源。攜帶這種來(lái)源的質(zhì)粒在大腸桿菌中以高拷貝數(shù)存在。

 

氨芐青素：氨芐青素抗性基因。它允許在大腸桿菌中通過(guò)選擇氨芐霉素來(lái)維持質(zhì)粒。

 

代表性矢量設(shè)計(jì)

VB ID矢量名稱(chēng)描述

VB010000-9486rey pRP[Exp]-CMV>EGFP/Puro一種編碼由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的EGFP:嘌呤霉素抗性融合蛋白的常規(guī)質(zhì)粒。

VB900120-0467nuf-pRP[Exp]-CAG>DD-Cre一種編碼不穩(wěn)定的Cre重組酶蛋白的常規(guī)質(zhì)粒，該蛋白在甲芐啶（TMP）存在下，在CAG啟動(dòng)子的控制下發(fā)揮作用。

精準(zhǔn)遺傳學(xué)：瀏覽Cre-lox工具箱

 

Cre-Lox系統(tǒng)是基因工程中的一種工具，可以精確控制基因表達(dá)和基因修飾。該系統(tǒng)由兩個(gè)主要成分組成：Cre重組酶和loxP位點(diǎn)。在這篇文章中，我們將回顧這兩個(gè)主要組件，并深入研究它們是如何每天在實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用的。在對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行概述后，我們將深入了解系統(tǒng)本身的進(jìn)展，以及如何使用系統(tǒng)來(lái)推進(jìn)發(fā)現(xiàn)。

 

“導(dǎo)致重組"-“交叉位點(diǎn)（x）P1"

 

Cre重組酶是一種來(lái)源于P1噬菌體的酶，在Cre-lox系統(tǒng)中發(fā)揮核心作用。首字母縮寫(xiě)Cre起初來(lái)源于術(shù)語(yǔ)“導(dǎo)致重組"；然而，今天它也被稱(chēng)為“環(huán)化重組酶"的縮短。這種酶具有識(shí)別被稱(chēng)為loxP位點(diǎn)的特定DNA序列并與之相互作用的特能力。

 

LoxP位點(diǎn)，簡(jiǎn)稱(chēng)“交叉位點(diǎn)（x）P1"，是由兩個(gè)13堿基對(duì)的反向和回文重復(fù)序列組成的特異性DNA序列，由一個(gè)8堿基對(duì)核心序列間隔區(qū)分隔。Cre是一種位點(diǎn)特異性重組酶，它識(shí)別13個(gè)堿基對(duì)的反向重復(fù)序列，核心區(qū)的序列賦予Cre-lox系統(tǒng)方向性。當(dāng)兩個(gè)loxP位點(diǎn)面向相反方向放置時(shí)，Cre重組酶使兩個(gè)位點(diǎn)之間的DNA片段翻轉(zhuǎn)。相反，當(dāng)兩個(gè)loxP位點(diǎn)在同一方向上位于DNA片段的兩側(cè)時(shí)，Cre重組酶切除位點(diǎn)之間的片段，導(dǎo)致遺傳信息的缺失。在基因組的不同位置面對(duì)相同方向的成對(duì)loxP位點(diǎn)允許易位（圖1）。

Cre-lox系統(tǒng)的特特性使其能夠應(yīng)用于基因工程中的幾種技術(shù)。Cre-lox系統(tǒng)受歡迎的應(yīng)用之一是用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠。在小鼠中，Cre-lox系統(tǒng)被廣泛用作條件基因操作的工具。研究人員將loxP位點(diǎn)戰(zhàn)略性地放置在靶基因周?chē)圃斐鲆环N“floxed"基因。然后，在特定啟動(dòng)子的控制下，用表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠培育這些小鼠，從而實(shí)現(xiàn)基因修飾的空間和時(shí)間控制（圖2）。當(dāng)Cre在特定組織或某些發(fā)育階段被激活時(shí)，它在loxP位點(diǎn)催化重組，導(dǎo)致靶基因的精確改變。這使得有條件的基因敲除、激活或其他修飾成為可能，以可控和動(dòng)態(tài)的方式深入了解基因功能。小鼠的Cre-lox系統(tǒng)已被證明在理解基因功能、建模疾病和開(kāi)發(fā)高精度的潛在治療干預(yù)措施方面是非常寶貴的。

 

例如，腫瘤抑制基因p53的條件敲除模型使研究人員能夠探索其在維持基因組穩(wěn)定性和防止不受控制的細(xì)胞生長(zhǎng)方面的作用。通過(guò)Cre-lox技術(shù)激活KRAS等致癌基因，可以研究它們對(duì)腫瘤發(fā)生和發(fā)展的特定貢獻(xiàn)。PTEN、BRCA1/BRCA2和E-鈣粘蛋白等基因的條件性敲除模型提供了對(duì)其在各種癌癥類(lèi)型（包括乳腺癌、卵巢癌和結(jié)直腸癌）中的作用的深入了解。這些模型通過(guò)允許以組織特異性或時(shí)間控制的方式靶向操縱特定基因，為揭示癌癥發(fā)展的復(fù)雜分子機(jī)制和在臨床前測(cè)試新的治療干預(yù)措施提供了寶貴的工具。

 

除了在小鼠系中使用外，Cre-lox系統(tǒng)經(jīng)常在體外用于受控的遺傳操作。這種方法使研究人員能夠利用非病毒載體，如含有loxP位點(diǎn)的質(zhì)?；?span>DNA構(gòu)建體，輕松地引入培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞系。這些loxP側(cè)翼序列可以被工程化以攜帶感興趣的基因、報(bào)告基因或其他功能元件。隨后，可以用表達(dá)Cre重組酶的單獨(dú)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)Cre的存在導(dǎo)致loxP位點(diǎn)之間的位點(diǎn)特異性重組，從而產(chǎn)生所需的遺傳修飾。

 

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