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Bio-Rad伯樂PCR儀檢出率低或無

1）PCR循環(huán)次數(shù)不足：將Bio-Rad伯樂PCR儀循環(huán)次數(shù)增加5個(gè)。

2）Bio-Rad伯樂PCR儀模板已降級(jí)：使用電泳檢查DNA質(zhì)量。

3）模板被PC抑制劑污染：1.檢查260和280nm處的DNA吸光度比。純DNA的260/280比例應(yīng)為≥1.8。2.在反應(yīng)中使用較少體積的模板。3.使用DNA純化試劑盒或乙醇沉淀去除 污染物。

4）熱循環(huán)儀程序退火和延伸溫度不是的：1.遵循PCR設(shè)計(jì)的一般規(guī)則：退火溫度=引物Tm – 5°C，延伸溫度=72°C。2.逐步將退火溫度降低6至10°C 。

5）反應(yīng)缺少Taq聚合酶或其他反應(yīng)組分：確保將每種組分添加到PCR反應(yīng)中。

6）Bio-Rad伯樂PCR儀引物濃度過低：檢查引物濃度；如有必要，增加注意力。

7）靶標(biāo)序列不在DNA模板中：1.從源頭重新提取脫氫酶。2.測(cè)試模板的另一個(gè)區(qū)域。

8）Bio-Rad伯樂PCR儀模板不足：增加DNA模板的濃度。

9）Bio-Rad伯樂PCR儀反應(yīng)組分濃度不理想：檢查推薦的引物濃度（通常從 0.05-1毫摩爾）和毫克++濃度（通常為0.2-1毫摩爾）。

10）反應(yīng)混合物組分受損：1.檢查組件的到期日期。2.等分試反應(yīng)混合物的生物成分，避免多次凍融循環(huán)。

11）引物設(shè)計(jì)不理想（導(dǎo)致非特異性退火或引物二聚體形成）：1.遵循底漆設(shè)計(jì)的一般規(guī)則：長(zhǎng)度為18-30 核苷酸，GC含量在40-60%之間，引物Tm在5°C以內(nèi)彼此。2.避免拉伸4個(gè)或更多相同的核苷酸或 二核苷酸重復(fù)。3.避免引物中的自互補(bǔ)序列。

來自Bio-Rad伯樂PCR儀反應(yīng)的多種/非特異性產(chǎn)物

1）引物設(shè)計(jì)不理想（導(dǎo)致非特異性退火或引物二聚體形成）：1.遵循底漆設(shè)計(jì)的一般規(guī)則：長(zhǎng)度為18-30 核苷酸，GC含量在40-60%之間，引物Tm在5°C以內(nèi)彼此。2.避免拉伸 4 個(gè)或更多相同的核苷酸或 二核苷酸重復(fù)。3.避免引物中的自互補(bǔ)序列。

2）Bio-Rad伯樂PCR儀模板或反應(yīng)混合物組分被污染：1.重新提取模板。2.嘗試新的反應(yīng)混合物。3.在反應(yīng)設(shè)置期間使用過濾器移液器吸頭并戴上手套。

3）Bio-Rad伯樂PCR儀退火溫度過低：逐步提高退火溫度。

4）Bio-Rad伯樂PCR儀引物濃度過高：少用底漆。

5）模板濃度不理想：1.對(duì)于質(zhì)粒，使用1 pg-10 ng的DNA / 50μl反應(yīng)。2.對(duì)于基因組DNA，使用1納克-1微克的DNA/ 50微升反應(yīng)。

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