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   　Bio-RadPCR儀 - 技術(shù)原理;

　　DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,在DNA聚合酶與啟動子的參與下,根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。在聚合酶鏈式反應實驗中發(fā)現(xiàn),DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈,當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制DNA的變性和復性,并設(shè)計引物做啟動子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。

　　但是,DNA聚合酶在高溫時會失活,因此,每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,不僅操作煩瑣,而且價格昂貴,制約了PCR技術(shù)的應用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義,該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,不需要每個循環(huán)加酶,使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低了成本,PCR技術(shù)得以大量應用,并逐步應用于。

　　1)內(nèi)參照法:在不同的PCR反應管中加入已定量的內(nèi)標和引物,內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記,下游引物不標記。在模板擴增的同時,內(nèi)標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中,由于內(nèi)標與靶模板的長度不同,二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高 效液相分離開來,分別測定其熒光強度,以內(nèi)標為對照定量待檢測模板。

　　2)競爭法:選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增(其中一個引物為熒光標記)。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段,而待測模板不被酶切,可通過電泳或高 效液相將兩種產(chǎn)物分開,分別測定熒光強度,根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

　　3)PCR-ELISA法:利用或生物等標記引物,擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結(jié)合,再加入抗或生物酶標-辣根酶結(jié)合物,最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實驗,若加入內(nèi)標,作出標準曲線,也可實現(xiàn)定量檢測目的。

　　BioRad酶標儀熒光分析技術(shù)是一種強大的分析手段，廣泛地應用在臨床檢驗、生物學研究、農(nóng)業(yè)科學、食品和環(huán)境科學中，是多功能酶標儀的重要應用，如TECAN(M1000、M200等)，Thmeral(Varioskan Flash)，Bio-tek（Synergy 4等），MD（M2、M5）都可以應用于熒光檢測。

　　BioRad酶標儀概述；

　　室溫下，大多數(shù)分子處于基態(tài)的振動能級，處于基態(tài)的分子吸收能量（光能、化學能、電能或熱能）后躍遷至激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，將很快衰變到基態(tài)，以光的形式放出能量，這種現(xiàn)象稱為“發(fā)光現(xiàn)象"。分子發(fā)光包括熒光，磷光，化學發(fā)光，生物發(fā)光等。受到光照時發(fā)光，光照切斷時發(fā)光立即消失的叫熒光，光照切斷時，發(fā)光逐漸變?nèi)跻灾孪У慕辛坠?，吸收化學反應的化學能量而發(fā)光叫化學發(fā)光，由生物能轉(zhuǎn)變?yōu)楣廨椛涞姆Q作生物發(fā)光。

　　由于發(fā)光物質(zhì)不同熒光有分子熒光和原子熒光之分，分子熒光為帶光譜，原子熒光為線光譜，通常所說的熒光為分子熒光。通過測定所發(fā)射熒光的特性和強度，可以對物質(zhì)進行定性、定量分析。

　　BioRad酶標儀熒光檢測技術(shù)；

　　1熒光強度

　　熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度成正比，這是熒光分析法是量分析的依據(jù)。在生物學上的應用非常廣泛，可以進行生物大分子定量，酶活性分析，熒光免疫分析，細胞學分析（細胞增殖，細胞毒理，細胞吸附等）和分子間相互作用。

　　1.1細胞凋亡檢測

　　Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小 亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，*終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。

　　設(shè)計出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Z-DEVD-AMC。在共價偶聯(lián)時，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據(jù)釋放的AMC熒光強度的大小，可以測定 caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。

　　1.2細胞毒性的檢測

　　體外細胞毒性研究對于檢測新的生物來源或人工合成的細胞毒素以及例行的臨床相關(guān)的檢測都有著重要的意義。非滲透性的核染料 Propidium iodide能穿透損傷的，熒光密度越高反映出其受損細胞越多。

　　1.3鈣流檢測

　　Fura-2、indo-1、Quin-2是Ca2+熒光指示劑，可以靈敏地反映細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，當結(jié)合鈣離子時，激發(fā)波長會發(fā)生改變，發(fā)射熒光的強度和結(jié)合的Ca2+濃度有著定量的關(guān)系。

　　2.熒光偏振(FP)

　　1926年P(guān)errin首先描述了熒光偏振理論，溶液中的熒光分子在受到偏振光照射時，可吸收并釋放出相應的偏振熒光，如果在激發(fā)時熒光物質(zhì)處于靜止狀態(tài)，發(fā)射光將保持原有激發(fā)光的偏振性，如果其處于運動狀態(tài)，發(fā)射光電偏振偏振平面將不同于原有激發(fā)光的偏振特性，這就是熒光偏振現(xiàn)象，熒光分子與其它因子的相互作用，例如相互結(jié)合或排斥；其所處環(huán)境的性質(zhì)，例如溶液的粘度、溫度等，這些因素都有可能對這個熒光因子受激發(fā)后發(fā)出的發(fā)射光的發(fā)射平面產(chǎn)生影響。因此以熒光偏振為基礎(chǔ)發(fā)展的技術(shù)可用來研究生命科學中分子之間的相互作用，如受體配體結(jié)合分析，DNA－蛋白質(zhì)結(jié)合分析，SNP分析，酶活性分析。

　　熒光偏振分析所需的樣品量少，靈敏度高，可達亞納摩爾級范圍，重復性好，操作簡便，也更為安全可靠，不會在實驗過程中生成有害的放射性，此外熒光偏振是真正均相的，允許實時檢測（動力學檢測），對于濃度變化不敏感，是均相檢測形式（中間不含洗滌步驟）的解決方案。

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