犬瘦素(LEP) ELISA 試劑盒

英文：Canine leptin (LEP) ELISA Kit

規(guī)格：96T/48T

試劑盒質(zhì)控數(shù)據(jù)

試劑盒的質(zhì)控和質(zhì)量密切相關(guān)。我們可以在說明書中可以找到質(zhì)控數(shù)據(jù)，在購買前應(yīng)檢查試劑盒是否進行過質(zhì)控實驗。檢查試劑盒是否經(jīng)過批次內(nèi)（Intra-Assay）及批次間（Inter-Assay）的精密度檢測、摻入回收實驗、線性稀釋實驗及交叉反應(yīng)等測試，確保試劑盒的結(jié)果重現(xiàn)性及準(zhǔn)確性。（CV% 一般小于 10% 比較好，線性和回收率的范圍在 80%-120% 比較合適）

試劑盒的有效期

一般試劑盒的有效期為半年到一年，樣本準(zhǔn)備的時間需要考慮進試劑盒的有效期。一般建議一個試劑盒一次用完，如確需分次使用，需確認標(biāo)準(zhǔn)品有多份。標(biāo)準(zhǔn)品稀釋之后需分管保存，理論上是48小時內(nèi)用完，但實在是樣本收集需要時間的話，盡量在一周內(nèi)用完。

抗原和抗體的結(jié)合范圍

在選擇試劑盒的時候還應(yīng)注意抗原和抗體的結(jié)合范圍是全長蛋白還是活體剪切體或者磷酸化特異性位點的蛋白。比如Human Caspase-7 ELISA Kit檢測的是全長蛋白，Human Cleaved Caspase-7(Asp198) ELISA Kit檢測的則是活體剪切體，Human Phospho-AKT1(S473) Quantitative ELISA kit檢測的是S473磷酸化的AKT1蛋白。應(yīng)根據(jù)自己實驗?zāi)康臏?zhǔn)確選擇相應(yīng)的試劑盒。

檢測的指標(biāo)數(shù)量

ELISA試劑盒更適合用于單個指標(biāo)的大量樣本檢測，如果檢測指標(biāo)超過 5 個，且樣本量較小時，ELISA 檢測方法并不是*。建議考慮多因子檢測方法，例如Raybiotech抗體芯片或者Luminex液相芯片方法，CBA檢測方法等

犬瘦素(LEP) ELISA 試劑盒   ELISA檢測系統(tǒng)是免疫學(xué)反應(yīng)應(yīng)用到科研生產(chǎn)中最為廣泛最為靈敏的技術(shù)手段，有著十分重要的作用。操作步驟雖然看起來比較簡單但是實驗過程有很多的操作要點需要掌握，操作步驟中如果稍有不慎，操作不合理的地方，就會造成很多問題從而影響到ELISA試劑盒檢測的準(zhǔn)確性，大大降低試驗質(zhì)量。比如說花板，ELISA試劑盒假陽性，全顯色，全部顯色，顯色比空白還低……這就需要我們在實驗過程中多做總結(jié)，逐步完善，還有就是要多多學(xué)習(xí)，分享學(xué)習(xí)心得。下面就大體總結(jié)一下ELISA實驗的常見問題和解決方法，同大家一起分享。

1、包被原的性質(zhì)很重要，蛋白濃度，是否降解，這關(guān)系到你做出的抗體可不可以被其識別，所以保存抗原很重要。還有有的包被原可能不是蛋白，對于生物素和脂類物質(zhì)或小分子物質(zhì)我們要事先對其改造再加以包被，我把方法簡要的列出如下:①親和素生物素:先親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。ELISA試劑盒②脂類物質(zhì):可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。③小分子必須依靠和大的蛋白載體偶聯(lián)后才能固定在固相載體上。

2、包被液的選擇，一般選擇ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時由于試驗的需要，包被原的特殊性也可能采用中性的緩沖溶液來包。應(yīng)注意以下原理：由于蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用，這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。具體的試驗還要有堅固的理論外也要實踐，看一下最終可不可以應(yīng)用到自己試驗當(dāng)中去。人ELISA試劑盒常用的包被液除了剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液，還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。

3、封閉：繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑有：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉，比較價廉，可以高濃度使用（5%-10%）;還有一些稀有用到的各種動物血清（主要為了排除相似蛋白干擾）和酪蛋白等等。但最終選用什么，要依據(jù)試驗具體來實踐。

4、洗滌板：可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。因為聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，為達到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的，清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)，在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。所以在洗板時會有一定誤差，人為因素很大（當(dāng)然有條件的用洗板機除外），洗的不*或串了孔，對如此靈敏的ELISA系統(tǒng)可是不小的影響。

5、加抗體標(biāo)本（和二抗）:注意該換槍頭時換槍頭。ELISA試劑盒標(biāo)本稀釋一般可用pbs稀釋，也可用封閉液去稀釋。如需加二抗，還要注意二抗的工作濃度，太高浪費，太低則著色淺。

6、顯色:顯色系統(tǒng)又很多，我們一開始做的時候，要選擇適宜的顯色系統(tǒng)。注意顯色系統(tǒng)酶活性底物的保存HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉。

7、每次做盡量要把陰陽空三個對照做好，如出現(xiàn)問題也好分析。

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