免疫沉淀實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù) 返回列表頁(yè)

詳細(xì)信息：

1.  表面標(biāo)記或生物合成標(biāo)記的細(xì)胞在裂解緩沖液中于4℃放置1 h 后，再于4℃3 000 g 離心10 min 除去細(xì)胞核，然后將所得上清在10000 g 離心1 min。

 2.  一次性對(duì)上清進(jìn)行預(yù)處理，每200 μl 上清加入10 μl 活化后被淬滅的瓊脂糖對(duì)照。在旋轉(zhuǎn)揺床中室溫?fù)e蕩2 h 或在4℃過(guò)夜。200 g 離心1 min，保留上清。

 3.  在1.5 ml 的微量離心管中加滿裂解液室溫作用10 min，對(duì)其進(jìn)行預(yù)包被。吸去液體后，加入105~106 cpm 的含抗原的放射性標(biāo)記上清，加稀釋緩沖液使終體積為200 μl。 

4.  加入10 μl 1：1的抗體-Sepharose偶聯(lián)物膠漿/稀釋緩沖液。4℃在旋轉(zhuǎn)搖床中搖蕩1. 5~3 h，一直保持Sepharose呈混懸狀。

5.  Sepharose偶聯(lián)物依次用1 ml 下面列出的緩沖液洗滌。毎次洗完后，200 g 離心5 min 或微量離心5 s。以細(xì)頭的巴斯德吸管小心吸去上清，僅在沉淀的上面留10 μl 的液體。在第4次洗滌后，離心甩下管壁所有殘余液滴并將其吸去，沉淀上僅留下約 10 μl。

6.   加入20~50 μl SDS樣品緩沖液。由于樣品緩沖液比重大于洗滌緩沖液，它可滲透到Sepharose中，不要用旋渦混合器旋起SEpharose，以免使之粘附在緩沖液液面以上的管壁。蓋緊蓋子，于100℃保溫5 min。

7.  用旋渦混合器混勻，200 g 離心或微量離心5 s。將上清加樣于凝膠以SDS-PAGE分析，使用增感屏進(jìn)行放射自顯影或熒光自顯影或檢測(cè)標(biāo)記蛋白質(zhì)。

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