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中級(jí)會(huì)員 | 第5年

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ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)服務(wù)

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所  在  地上海市

更新時(shí)間:2024-03-01 11:08:36瀏覽次數(shù):370次

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酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay,ELISA)是免疫學(xué)和分子生物學(xué)中廣泛使用的實(shí)驗(yàn)室技術(shù),由Eva Engvall和 Peter Perlmann 于1971 sc描述。該測(cè)定依賴于抗原-抗體相互作用的原理,并利用酶和比色檢測(cè)來(lái)量化目標(biāo)分子,主要用于檢測(cè)和量化生物樣品中特定蛋白質(zhì)、肽、抗體或抗原的存在。ELISA測(cè)定通常應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域,包括臨床

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 樣品準(zhǔn)備

a. 細(xì)胞上清樣品,需將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞消化離心取上清即可(如800g,5分鐘)。

b. 血清樣品,將全血收集至不含抗凝劑的試管內(nèi),在室溫下放置1小時(shí),待全血自然凝固并析出血清后,4℃1500g離心10分鐘,取黃色上清即得血清。

c. 血漿樣品,將全血收集至含抗凝劑的試管內(nèi),混勻后置冰上,4℃1500g離心10分鐘,取黃色或淡黃色上清即得血漿。

2. 確定樣品測(cè)試組、標(biāo)準(zhǔn)品和空白組組所需的微孔條數(shù)量,每個(gè)濃度做兩個(gè)平行重復(fù),從支架上取出對(duì)應(yīng)數(shù)量的微孔條,剩余儲(chǔ)存在箔袋中,密封后在4℃儲(chǔ)存。

3. 配制對(duì)應(yīng)濃度的捕獲抗體溶液、檢測(cè)抗體溶液、包被液、洗滌液、樣品稀釋液、顯色液、終止液、鏈霉親和素-HRP(若使用試劑盒則沒有此步驟或按試劑盒要求配制)。

4. 每孔加入100μL 捕獲抗體溶液,用封板膜覆蓋,4℃孵育過夜,過夜后舍棄舍板內(nèi)溶液。

5. 每孔加入300-400μL洗滌液清洗五次,且最后一次置于厚吸水紙上拍干(若使用試劑盒則沒有步驟45)。

6. 用樣品稀釋液按照1:5, 1:10, 1:50, 1:100, 1:1000, 1:2000稀釋樣品,以此確定樣品IL-2的最佳檢測(cè)濃度。

7. 配制梯度濃度的IL-2蛋白標(biāo)準(zhǔn)品,將工作濃度設(shè)置為1200pg/mL, 600pg/mL, 300pg/mL, 150pg/mL, 75pg/mL, 37.5pg/mL, 18.75pg/mL,9.38pg/mL,以此濃度來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

8. 分別將樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液按照100μL/孔加入相應(yīng)孔中作為標(biāo)測(cè)試組、標(biāo)準(zhǔn)品組、空白組。

9. 將偶聯(lián)sws的抗人IL-2抗體按照50μL/孔加入所有孔中,用封板膜覆蓋,室溫避光孵育2小時(shí)。

10. 每孔加入300-400μL洗滌液洗板五次,且最后一次置于厚吸水紙上拍干。

11. 在所有孔加入100μL稀釋后的鏈霉親和素-HRP,用封板膜覆蓋,室溫避光孵育1小時(shí)。

12. 每孔加入300-400μL洗滌液洗板五次,且最后一次置于厚吸水紙上拍干。

13. 在所有孔中加入100μL TMB顯色液。用封板膜覆蓋,室溫避光孵育30min。

14. 在所有孔中加入終止液50μL,混勻后立即測(cè)量A450值。

15. 計(jì)算每一組重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的平均吸光度值。重復(fù)次數(shù)應(yīng)在平均值的20%以內(nèi)。

16. 繪制IL-2標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),A450值為縱坐標(biāo),以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)。通過樣品的吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的相應(yīng)濃度。


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