產(chǎn)品說明:
Fluo-4是一種將Fluo-3結(jié)構(gòu)中的Cl替換成F的鈣熒光探針。由于將CI替換成了電子吸引力更強(qiáng)的F,它的大激發(fā)波長會向短波長處偏離10nm左右。這個(gè)波長更接近于氬激光器的波長，所以用氬激光器激發(fā)時(shí)，F(xiàn)luo-4 的熒光強(qiáng)度比Fluo-3強(qiáng)一倍。Fluo-4,AM穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fluo-4，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)luo-4若以游離配體形式存在時(shí)幾乎是非熒光性的，但是當(dāng)它與細(xì)胞內(nèi)鈣離子結(jié)合后可以產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，大激發(fā)波長為494nm，大發(fā)射波長為516nm。可以使用激光共聚焦顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。
操作說明:
1.向Fluo-4,AM/DMSO溶液中加入等體積的20%的Pluronic F127溶液，Pluronic F127可以防止Fluo-4,AM在HBSS中聚合并能夠幫助其進(jìn)入細(xì)胞。
注意:不建議在Pluronic FI27中*保存Fluo-4,AM溶液。Pluronic F127的量可以適當(dāng)調(diào)整。PluronicF127和Fluo4,AM一定要確保*溶解后才可使用。.
2.用HBSS稀釋Fluo-4, AM溶液，制備4-5μM的Fluo-4, AM工作液。
注意:為了避免過度加載造成細(xì)胞毒性，建議在取得有效結(jié)果的基礎(chǔ)上盡量使用低探針濃度。
3.將Fluo-4, AM工作液加入細(xì)胞，在37C培養(yǎng)20分鐘。
4.加入5倍體積的含有1%胎牛血清的HBSS,再繼續(xù)培養(yǎng)40分鐘。
5. 用HEPES buffer saline洗滌細(xì)胞3次，然后用HEPES bffer saline使細(xì)胞重懸浮，制成1X 10>
cells/mL的溶液。
6. 37C下培養(yǎng)10分鐘，然后用該細(xì)胞進(jìn)行熒光鈣離子檢測。激發(fā)波長506nm， 發(fā)射波長526nm。
*標(biāo)記的條件因細(xì)胞種類而異，在每次實(shí)驗(yàn)前，請先確定條件。以上方法僅供參考。
注意事項(xiàng):
1、如果使用含有血清的培養(yǎng)基，血清中的脂酶會分解AM體，從而降低Fluo-4,AM進(jìn)入細(xì)胞的效果。另外，含有酚紅的培養(yǎng)基會使本底值略微偏高，所以加工作液之前，應(yīng)該盡量去除培養(yǎng)基殘留。
2、熒光染料均存在萃滅問題，請注意避光，以減緩熒光萃滅。