免疫熒光實(shí)驗(yàn) 返回列表頁(yè)

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種，抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體上標(biāo)記熒光基因，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細(xì)胞或者組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位基本流程

1.細(xì)胞準(zhǔn)備。對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí),將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過(guò)的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待
細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次;對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，PBS離心洗滌
(1000rpm,5min) 2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片
2.定。根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮納的PBS中4°C保存3個(gè)
月。PBS洗滌3x5 min
3.通透。使用交聯(lián)劑(如多聚甲醛)固定后的細(xì)胞，一般需要 在加入抗體孵育前，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透處理,
以保證抗體能夠到達(dá)抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時(shí)間一般在5-15min.通透
后用PBS洗滌3x5 min
4.封閉。使用封閉液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行封閉，時(shí)間一般為30min
5.一抗結(jié)合。室溫孵育1h或者4°C過(guò)夜。 PBST漂洗3次， 每次沖洗5min
6.二抗結(jié)合。間接兔疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次,每次沖洗5min后，用蒸餾
水漂洗-次
7.封片及檢測(cè)。滴加封片劑- -滴， 封片，熒光顯微鏡檢查