細胞培養(yǎng)的具體步驟和要求以及注意事項

一、細胞復(fù)蘇

將凍存細胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動促進其融化。移人15ml離心管中，加入10ml預(yù)熱的DMEM*培養(yǎng)基，輕輕吹勻，離心，2000rpmX2min，棄上清液。

二、細胞傳代

加入10ml PBS清洗細胞培養(yǎng)盤，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。再加入10ml PBS（經(jīng)高壓滅菌，保存于40C），吹勻，吸取10微升進行計數(shù)，按照1×106/盤接種，在含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

細胞密度達到80%～90%時，去培養(yǎng)基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人細胞培養(yǎng)箱3min。加入lmlDMEM*培養(yǎng)基終止胰酶消化，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。加入10ml PBS清洗細胞培養(yǎng)盤，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。

凍存液的配制：70%的*培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。

（1）進入細胞間開始細胞培養(yǎng)時，必須嚴格按照下列步驟操作：

②確定衣服的袖口已經(jīng)卷起或者白大褂的袖口已經(jīng)扎緊。

④確定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。為了方便單手開啟瓶蓋，實驗開始前可以把所有瓶蓋旋松。

⑥操作時如果不能肯定所用的耗材是潔凈的，必須及時更換。

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