培養(yǎng)基的制備與滅菌

一、目的要求

1. 掌握微生物實(shí)驗(yàn)室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。

2. 掌握培養(yǎng)基的配置原則和方法。

3. 掌握高壓蒸汽滅菌的操作方法和注意事項(xiàng)。

二、基本原理

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：

是一種應(yīng)用*泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有時(shí)又稱為普通培養(yǎng)基。由于這種培養(yǎng)基中含有一般細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需要的最基本的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以可供細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖之用。

高壓蒸汽滅菌：

主要是通過(guò)升溫使蛋白質(zhì)變性從而達(dá)到殺死微生物的效果。將滅菌的物品放在一個(gè)密閉和加壓的滅菌鍋內(nèi)，通過(guò)加熱，使滅菌鍋內(nèi)水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待蒸汽將鍋內(nèi)冷空氣從排氣閥中趨盡，關(guān)閉排氣閥繼續(xù)加熱。此時(shí)蒸汽不溢出，壓力增大，沸點(diǎn)升高，獲得高于100℃的溫度導(dǎo)致菌體蛋白凝固變性，而達(dá)到滅菌的目的。

三、實(shí)驗(yàn)材料

1. 藥品：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。

2. 儀器及玻璃器皿：天平、高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、試管、燒杯、量筒、三

角瓶、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗等。

3. 其他物品：藥匙、稱量紙、pH試紙、記號(hào)筆、棉花等。

四、操作步驟

（一）玻璃器皿的洗滌和包裝

1．玻璃器皿的洗滌

玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。將三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、量筒等浸入含有洗滌劑的水中．用毛刷刷洗，然后用自來(lái)水及蒸餾水沖凈。移液管先用含有洗滌劑的水浸泡，再用自來(lái)水及蒸餾水沖洗。洗刷干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用。

2．滅菌前玻璃器皿的包裝

（1） 培養(yǎng)皿的包扎：培養(yǎng)皿由一蓋一底組成一套，可用報(bào)紙將幾套培養(yǎng)皿包

成一包，或者將幾套培養(yǎng)皿直接置于特制的鐵皮圓筒內(nèi)，加蓋滅菌。包裝后的培養(yǎng)皿須經(jīng)滅菌之后才能使用。

（2） 移液管的包扎：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脫脂棉)，它的作

用是避免外界及口中雜菌進(jìn)入管內(nèi)，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花應(yīng)距管口約0.5cm左右，棉花自身長(zhǎng)度約1~1.5cm。塞棉花時(shí)．可用一外圍拉直的曲別針、將少許棉花塞入管口內(nèi)。棉花要塞得松緊適宜，吹時(shí)以能通氣而又不使棉花滑下為準(zhǔn)。

先將報(bào)紙裁成寬約5cm左右的長(zhǎng)紙條，然后將已塞好棉花的移液管頂部

放在長(zhǎng)條報(bào)紙的一端，約成45℃角，折疊紙條包住頂部，用左手握住移液管身，有手將移液管壓緊．在桌面上向前搓轉(zhuǎn)，以螺旋式包扎起來(lái)。上端剩余紙條，折疊打結(jié)，準(zhǔn)備滅菌。

（二）液體及固體培養(yǎng)基的配制過(guò)程

1．液體培養(yǎng)基配制

（1）稱量（假定配制1000ml培養(yǎng)基）

按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取3.0g牛肉膏、10.0 g蛋白胨、5.0gNaCl放入燒杯（或1000ml刻度搪瓷杯）中．牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯。

（2）溶化

在上述燒杯中先加入少于所需要的水量（如約700ml），用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解，將藥品*溶解后，補(bǔ)充水到所需的總體積（1000ml）；如果配制固體培養(yǎng)基時(shí)，將稱好的瓊脂放人已溶的藥品中，再加熱溶化，最后補(bǔ)足所損失的水分。

（3）調(diào)pH

調(diào)pH：一般用pH試紙測(cè)定培養(yǎng)基的pH。用剪刀剪出一小段pH試紙，然后用鑷子夾取此段pH試紙，在培養(yǎng)基中蘸一下，觀看其pH范圍，如培養(yǎng)基偏酸或偏堿時(shí)，可用1mol/L NaoH或1mol/L HCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)pH時(shí)，應(yīng)逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部過(guò)酸或過(guò)堿，破壞培養(yǎng)基中成分。邊加邊攪拌，并不時(shí)用pH試紙測(cè)試，直至pH達(dá)7.4-7.6。反之，用1mol／LHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。

2．固體培養(yǎng)基的配制

配制固體培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)將已配好的液體培養(yǎng)基加熱煮沸，再將稱好的瓊脂(1.5~2％)加

入，并用玻棒不斷攪拌，以免糊底燒焦。繼續(xù)加熱至瓊脂全部融化，最后補(bǔ)足因蒸發(fā)而失去水分。

（三）培養(yǎng)基的分裝

根據(jù)不同需要，可將已配好培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶?jī)?nèi)，分裝時(shí)注意不要使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培養(yǎng)基沾污管口或瓶口時(shí)，可用鑷子夾一小塊脫脂棉，擦去管口或瓶口的培養(yǎng)基，并將脫脂棉棄去。

1．試管的分裝

取一個(gè)玻璃漏斗，裝在鐵架上，漏斗下連一根橡皮管，橡皮管下端再與另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一彈簧夾。分裝時(shí)，用左手拿住空試管中部，并將漏斗下的玻璃管嘴插入試管內(nèi)，以右手拇指及食指開(kāi)放彈簧夾，中指及無(wú)名指夾佐玻璃管嘴，使培養(yǎng)基直接流入試管內(nèi)。裝入試管培養(yǎng)基的量視試管大小及需要而定，若所用試管大小為15×150 mm時(shí)，液體培養(yǎng)基可分裝至試管高度1／4左有為宜；如分裝固體或半固體培養(yǎng)基時(shí)，在瓊脂*融化后，應(yīng)趁熱分裝于試管中。用于制作斜面的固體培養(yǎng)基的分裝量為管高1／5(約3—4mI)，半固體培養(yǎng)基分裝量為管高的1／3為宜。

2．三角瓶的分裝

用于振蕩培養(yǎng)微生物時(shí)，可在250 m1

用于制作

平板培養(yǎng)基用時(shí)，可在250 m1三角瓶中加入150ml

粉(按2％計(jì)算)，滅菌時(shí)瓶中瓊脂粉同時(shí)被融化。

（四）棉塞的制作及試管、三角瓶的包扎

為了培養(yǎng)好氣性微生物，需提供優(yōu)良通氣條件，同時(shí)為防止雜菌污染，則必須對(duì)通入試管或三角瓶?jī)?nèi)空氣預(yù)*行過(guò)濾除菌。通常方法是在試管及三角瓶口加上棉花塞等。

1．試管棉塞的制作

制棉塞時(shí)，應(yīng)選用大小、厚薄適中的普通棉花一塊，鋪展于左手拇指和食指扣成的團(tuán)孔上，用右手食指將棉花從中央壓入團(tuán)孔中制成棉塞．然后直接壓入試管或三角瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折疊卷塞法制作棉塞。

制作的棉塞應(yīng)緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入，棉塞不宜過(guò)緊或過(guò)松，塞好后以手提棉塞，試管不下落為準(zhǔn)。棉塞的2／3在試管內(nèi)，1／3在試管外。目前也有采用硅膠塞代替棉塞直接蓋在試管口上。

將裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或硅膠塞的試管捆成一捆，外面包上一層牛皮紙。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱及配制日期，滅菌待用。

2．三角瓶棉塞制作

通常在棉塞外包上一層紗布，再塞在瓶口上。有時(shí)為了進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)加大通氣量，則可用8層紗布代替棉塞包在瓶口上，目前也有采用硅膠塞直接蓋在瓶口上。

在裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或包扎八層紗布或蓋好硅膠塞的三角瓶口上，再包上一層牛皮紙并用線繩捆好，滅菌待用。

（五）培養(yǎng)基的滅菌

將上述培養(yǎng)基以0.103MPa，l21℃，20min高壓蒸氣滅菌。

滅菌過(guò)程：

1. 加水：首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面沒(méi)過(guò)加熱蛇

管，與三角擱架相平為宜。切勿忘記檢查水位，加水量過(guò)少，滅菌鍋會(huì)發(fā)生燒干引起炸裂事故。

2. 裝料：放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌的物品。注意不要裝得太擠，以免妨礙蒸

汽流通而影響滅菌效果。裝有培養(yǎng)基的容器放置時(shí)要防止液體溢出，三角瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包扎的紙而透入棉塞。

3. 加蓋：將蓋上與排氣孔相連的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)，擺正鍋蓋，

對(duì)齊螺口，然后以對(duì)稱方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣，并打開(kāi)排氣閥。

4. 排氣：打開(kāi)電源加熱滅菌鍋，將水煮沸，使鍋內(nèi)的冷空氣和水蒸汽一起從排

氣孔中排出。一般認(rèn)為當(dāng)排出的氣流很強(qiáng)并有噓聲時(shí)，表明鍋內(nèi)的空氣已排盡，沸騰后約需5分鐘。

5. 升壓：冷空氣*排盡后，關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，鍋內(nèi)壓力開(kāi)始上升。

6. 保壓：當(dāng)壓力表指針達(dá)到所需壓力時(shí)，控制電源，開(kāi)始計(jì)時(shí)并維持壓力至所

需的時(shí)間。如本實(shí)驗(yàn)中采用0.1Mpa，121.5℃，20分鐘滅菌。

滅菌的主要因素是溫度而不是壓力，因此鍋內(nèi)的冷空氣必須*排盡后，才能關(guān)閉排氣閥，維持所需壓力。

7. 降壓：達(dá)到滅菌所需的時(shí)間后，切斷電源，讓滅菌鍋溫度自然下降，當(dāng)壓力

表的壓力降至“0”后，方可打開(kāi)排氣閥，排盡余下的蒸汽，旋松螺栓，打開(kāi)鍋蓋，取出滅菌物品，倒掉鍋內(nèi)剩水。壓力一定要降到“0”后，才能打開(kāi)排氣閥，開(kāi)蓋取物。否則就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基或

試劑由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出容器口，造成瓶口被污染，甚至灼傷操作者。

（六）斜面和平板的制作

1．斜面的制作

將已滅菌裝有瓊脂培養(yǎng)基的試管，趁熱置于木棒或玻棒上，使成適當(dāng)斜度，凝固后即成斜面。斜面長(zhǎng)度不超過(guò)試管長(zhǎng)度l／2為宜。如制作半團(tuán)體或固體深層培養(yǎng)基時(shí)，滅菌后則應(yīng)垂直放置至凝固。

2．平板的制作

將裝在三角瓶或試管中已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基融化后，待冷至50℃左右傾入無(wú)菌培養(yǎng)皿中。溫度過(guò)高時(shí)，皿蓋上的冷凝水太多；溫度低于50℃，培養(yǎng)基易于凝固而無(wú)法制作平板。

平板的制作應(yīng)在火旁進(jìn)行，左手拿培養(yǎng)皿，右手拿三角瓶的底部或試管，左手同時(shí)用小指和手掌將棉塞打開(kāi)，灼燒瓶口，用左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開(kāi)一縫，至瓶口正好伸入，傾入10~15mL培養(yǎng)基，迅速蓋好皿蓋，置于桌上，輕輕旋轉(zhuǎn)平皿，使培養(yǎng)基均勻分布于整個(gè)平皿中，冷凝后即成平板。

（七）培養(yǎng)基的滅菌檢查

滅菌后的培養(yǎng)基，一般需進(jìn)行無(wú)菌檢查。最好取出1~2管(瓶)，置于37℃溫箱中培養(yǎng)1~2天，確定無(wú)菌后方可使用。

篇二：培養(yǎng)基的制備與滅菌實(shí)驗(yàn)報(bào)告(詳細(xì))

一、實(shí)驗(yàn)題目：培養(yǎng)基的制備與滅菌

二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>

1、明確培養(yǎng)基的配置原則，掌握配置方法。

2、了解滅菌的原理，學(xué)習(xí)掌握滅菌器的使用方法。

三、實(shí)驗(yàn)器材：

1、藥品：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、水、瓊脂。

2、儀器：三角瓶、培養(yǎng)皿、試管、線繩、棉花、燒杯、報(bào)紙、移液管、試管架、鐵針、量筒。

四、實(shí)驗(yàn)原理：

1、培養(yǎng)基的制備

包括一下幾種成分：

（1）水分：主要成分。

（2）N源：包括無(wú)機(jī)氮和有機(jī)氮。

（3）C源：主要是含碳有機(jī)物、碳?xì)浠衔锏取?/span>

（4）無(wú)機(jī)鹽：如NaCl、KH2PO4等。

微量元素：Cu、K、Mg、S、P、Zn。

有些還需要添加“生長(zhǎng)因子”，通常是維生素類、某些氨基酸或核酸等。

2、培養(yǎng)基配置的原則

根據(jù)不同的培養(yǎng)對(duì)象及培養(yǎng)目的，選用不同的培養(yǎng)基，但有機(jī)物總量不得超過(guò)15%，鹽類一般不超過(guò)1%。

培養(yǎng)基有以下分類：

按成分：天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基

按狀態(tài)：固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基

按用途：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基

培養(yǎng)基配好后應(yīng)立即滅菌，防止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)中的微生物富集。

3、滅菌：

用理化手段殺滅一切微生物的營(yíng)養(yǎng)體，包括芽孢和孢子，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)對(duì)所有儀器、操作場(chǎng)所、藥品及培養(yǎng)基滅菌或消毒。

（1）高壓蒸汽滅菌：將物品放入封閉的加壓滅菌器，加熱使滅菌鍋套間的水沸騰產(chǎn)生蒸汽，將冷空氣排盡，壓力上升，使水沸點(diǎn)變高，導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)變性，一般0.1MPa、121℃、15~30min可以*滅菌，本次實(shí)驗(yàn)滅菌20min。若是含糖培養(yǎng)基，110℃、30min。

（2）干熱滅菌：微生物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)因高溫而凝固變性。因高溫，所以含水量小，不利于蛋白質(zhì)受熱變性，所以溫度高，時(shí)間長(zhǎng)。

（3）紫外滅菌：誘導(dǎo)胸腺嘧啶二聚體形成抑制DNA復(fù)制。

（4）過(guò)濾除菌：實(shí)驗(yàn)室中用微孔濾膜（孔徑一般為0.22μm）。除病菌需更小。

五、實(shí)驗(yàn)步驟：

1、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備

依次準(zhǔn)確稱取0.5g牛肉粉、1.0g蛋白胨、0.5gNaCl放入燒杯，加入100mL水，用玻璃棒攪勻溶解，移入三角瓶，并加入1.5g瓊脂。加上棉塞，迅速拔出能發(fā)出清脆聲響即可，用報(bào)紙包住并系好麻繩。

2、包移液管和培養(yǎng)皿

（1）包一包培養(yǎng)皿（一包五個(gè)）：用手壓緊、塞好，折出棱角，包好后搖晃沒(méi)有培養(yǎng)皿相互碰撞的聲音即可。

（2）包2支移液管：用棉花塞好移液管尾部，露出1~2cm即可。取長(zhǎng)條報(bào)紙，一端折

90°角，緊密嚴(yán)實(shí)沿30°角卷好移液管，尾部疊好防止散開(kāi)。

3、高壓蒸汽滅菌

（1）滅菌前要先看水位是否合適。

（2）將包好的待滅菌物品放入內(nèi)層鍋，不要裝得太擠，棉塞不應(yīng)染上培養(yǎng)基。

（3）加蓋，兩兩對(duì)稱旋緊螺栓。

（4）設(shè)定條件：0.1MPa、121℃、20min，進(jìn)行加熱。

（5）先打開(kāi)排氣閥，待空氣排盡后，關(guān)上排氣閥。

（6）結(jié)束后，自然降溫，壓力降為0后，打開(kāi)排氣閥取出物品。

4、干熱滅菌

（1）將包好的待滅菌物品放入電熱干燥箱內(nèi)，關(guān)好門箱。

（2）設(shè)定條件：160~170℃，恒溫2h。

（3）結(jié)束后，切斷電源，自然降溫，降到70℃以下后開(kāi)箱取物。

六、思考題：

1、你配制的是什么培養(yǎng)基？

選擇培養(yǎng)基。

2、選擇培養(yǎng)基與鑒別培養(yǎng)基的區(qū)別？這兩種培養(yǎng)基的應(yīng)用情況。

選擇培養(yǎng)基是指根據(jù)某種微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)要求或其對(duì)某化學(xué)、物理因素的抗性而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基。其功能是使混合菌樣中的劣勢(shì)菌變成優(yōu)勢(shì)菌，從而提高該菌的篩選效率。如以纖維素作碳源的培養(yǎng)基可分散到分解纖維素的微生物分散酵母菌或霉菌時(shí)，可添加適量的青霉素、四環(huán)素或鏈霉素，以抑制細(xì)菌和放線菌的生長(zhǎng)。

鑒別培養(yǎng)基是在成分中加入有能與目的菌的無(wú)色代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)的指示劑，從而達(dá)到只須用肉眼辨別顏色就能方便地從近似菌落中找到目的菌菌落的培養(yǎng)基，此類培養(yǎng)基一般用于鑒定不同微生物。如EMB即伊紅美乳糖造就基。大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)生大量混合酸，可染上酸性伊紅，伊紅和美蘭結(jié)合，菌落被染成深紫色，從菌落外貌的發(fā)射光中還可以看到綠色金屬發(fā)光。

篇三：實(shí)驗(yàn)二 培養(yǎng)基的配制和滅菌

實(shí)驗(yàn)二 培養(yǎng)基的配制和滅菌

一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

微生物的生長(zhǎng)發(fā)育都有一定的營(yíng)養(yǎng)需要，培養(yǎng)基即人工培養(yǎng)微生物、為其生長(zhǎng)發(fā)育提供所需營(yíng)養(yǎng)的基質(zhì)。培養(yǎng)基配好后必須經(jīng)過(guò)滅菌方能用于分離培養(yǎng)微生物試驗(yàn)，因此培養(yǎng)基的配制和滅菌是植物病理實(shí)驗(yàn)室中最基本的工作，通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)植病實(shí)驗(yàn)室中常用培養(yǎng)基的配制方法和高壓滅菌鍋的使用方法。

二、內(nèi)容、材料和方法

(一)培養(yǎng)基的配制

培養(yǎng)基按組成成分及對(duì)這些成分了解的程度分為天然培養(yǎng)基、半組合培養(yǎng)基和組合培養(yǎng)基三類，從物理性質(zhì)上又分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基兩類，培養(yǎng)基的種類不同，配制方法也有差異，限于時(shí)間，本次實(shí)驗(yàn)僅配制馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。1馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）

這是植病實(shí)驗(yàn)室常用的培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱PSA)，主要用于植物病原真菌的分離和培養(yǎng)，有時(shí)也用于植物病原細(xì)菌。

成分：馬鈴薯200克

蔗 糖 10~20克

瓊 脂 17~20克

加水至1000毫升

方法：將馬鈴薯洗凈去皮切塊，加水煮沸半小時(shí)，用雙層紗布濾去薯塊，補(bǔ)足水量，加入瓊脂，加熱熔化，再加糖，待*化后，乘熱用雙層紗布過(guò)濾分裝，塞好棉塞高壓滅菌。馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基略帶酸性，培養(yǎng)真菌無(wú)需調(diào)節(jié)pH，培養(yǎng)細(xì)菌則調(diào)節(jié)pH至中性，此培養(yǎng)基留作下次實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)病原真菌用，故不必調(diào)節(jié)pH。

5人分作一組，1、2組各作此培養(yǎng)基500毫升，其中200毫升分裝試管，每管約10毫升，滅菌后擺成斜面；其余300毫升，分裝在3個(gè)250—300毫升的三角瓶中，每瓶裝100毫升左右，滅菌后妥善保存，留待下次實(shí)驗(yàn)使用。

2肉汁胨培養(yǎng)基（BPA）

這種培養(yǎng)基主要用于細(xì)菌的分離和培養(yǎng)

成分：牛肉浸膏 3克

蛋白胨 5~10克

蔗糖 10克

酵母浸膏 1克

瓊脂 17~20克

加水至 1000毫升

方法：先將瓊脂加熱熔化于大部水中，再將其它各成分用少量水化開(kāi)加入，調(diào)節(jié)pH至7，趁熱用雙層紗布過(guò)濾，分裝，塞棉塞高壓滅菌。

牛肉浸膏和酵母浸膏十分粘稠，不易稱重，稱重時(shí)用小燒杯盛裝，以玻璃棒沾取，故要先稱好杯和棒的重量后，再開(kāi)始沾取浸膏稱重，稱后將杯和棒上粘著的浸膏洗凈于鍋中。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至中性的方法如下：配成1N的HCl和NaOH，并另分別稀釋配成1/20 N的HCl和NaOH。取培養(yǎng)基2毫升，加蒸餾水7.5毫升，加指示劑溴百里酚藍(lán)指示劑5滴，這時(shí)如培養(yǎng)基的測(cè)樣呈黃色則用有刻度吸管加入1/20 N的NaOH若呈藍(lán)色則加入1/2O N的

HCl，使培養(yǎng)基最后呈草綠色即調(diào)節(jié)到中性，此刻所加酸或堿的毫升數(shù)的25倍即等于在1000毫升培養(yǎng)基中所需要加入lN 的NaOH或HCl的毫升數(shù)(注意這次是作500毫升培養(yǎng)基)，加蒸餾水稀釋的目的防止調(diào)節(jié)過(guò)程中培養(yǎng)基凝固。

調(diào)節(jié)pH至中性的簡(jiǎn)便方法是用石蕊示紙。也可以用多孔白色瓷板，在孔中加少量培養(yǎng)基和溴百里酚藍(lán)或其它指示劑1—2滴，根據(jù)顏色反應(yīng)，在所配的培養(yǎng)液中加入少量lN的NaOH或HCl，然后再取樣測(cè)定，如此反復(fù)多次，達(dá)到所需求的反應(yīng)為止。

5人分為一組，3、4兩組各作此培養(yǎng)基500毫升，其中200毫升分裝試管，每管約100毫升，滅菌后擺成斜面，其余300毫升分裝在3個(gè)250—300毫升的三角瓶中，每瓶裝100毫升左右，滅菌后妥善存放，留待下次實(shí)驗(yàn)使用。

此外，1、2、3、4各組均制備15管試管裝和2瓶三角瓶裝的無(wú)菌水。

(二)培養(yǎng)基的滅菌

為了得到某種病原物的純培養(yǎng)，配好的培養(yǎng)基必須經(jīng)過(guò)滅菌才能使用，滅菌是指用物理或化學(xué)方法*殺死器物表面及其內(nèi)部的所有微生物，滅菌與消毒的概念不同，消毒則是指消滅器物或植物組織表面的某些微生物(能常稱雜菌)，而不是消滅所有的微生物。

滅菌的方法很多，植病實(shí)驗(yàn)室常用的有干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌兩種方法，一般培養(yǎng)皿、吸管等玻璃儀器用干熱滅菌法進(jìn)行滅菌。而培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)用的土壤，則用高壓蒸汽滅菌法進(jìn)行滅菌，具體滅菌方法和步驟如下：

1干熱滅菌法

(1)將培養(yǎng)皿、吸管等玻璃器皿洗凈干燥后，用舊報(bào)紙包好，或裝入特制的鐵筒中(每個(gè)吸管用紙包好后裝入鐵筒)，包紙時(shí)應(yīng)將吸取的一端放在取時(shí)先折開(kāi)的一端，以便取用時(shí)手勿觸及要求滅菌的一端。

(2)將包裝好的玻璃儀器擺入電熱烘箱中，彼此間留有一定的空隙以便流通空氣。

(3)關(guān)緊箱門，打開(kāi)排氣孔接上電源。

(4)待箱內(nèi)空氣排出到一定程度時(shí)，閉上排氣孔，繼續(xù)加熱至一定溫度后，用定溫固定溫度，滅菌溫度一般165℃—175℃保持1小時(shí)即可。

(5)待自然降溫冷卻后(60℃以下)才能開(kāi)門取出玻璃器皿，避免由于溫度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。

2高壓蒸汽滅菌法

高壓蒸汽滅菌法又稱濕熱滅菌，它的原理是利用高壓來(lái)提高蒸汽的溫度，達(dá)到滅菌的目的，其操作步驟如下：

(1)關(guān)好排水閥門放入清水至標(biāo)度為止，注意水量一定要加足，否則容易造成事故。

(2)將要滅菌的培養(yǎng)基、滅菌水等裝入鐵絲籠中，并用牛皮紙蓋好后放入滅菌鍋中，關(guān)上器蓋，旋緊螺旋時(shí)，先將每個(gè)螺旋旋轉(zhuǎn)到一定程度(不要太緊)，然后再旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺旋，以達(dá)到平衡旋緊，否則易造成漏氣，達(dá)不到*滅菌的目的。

(3)通電加溫，同時(shí)打開(kāi)排氣活門，排盡鍋內(nèi)的空氣，即活門沖出的全部是蒸氣時(shí)則表示*，此時(shí)可關(guān)閉排氣活門，如果過(guò)早關(guān)閉活門，排氣不*，也達(dá)不到*滅菌的目的。通常當(dāng)壓力表指針升至5磅時(shí)，打開(kāi)排氣活門放氣，降至零點(diǎn)，再關(guān)閉活門。

(4)壓力表的指針上升時(shí)，鍋內(nèi)溫度也逐漸升高，當(dāng)壓力表指針升至15磅時(shí)，蒸氣溫度相當(dāng)于120℃—121℃(等于一個(gè)大氣壓)，此時(shí)開(kāi)始計(jì)算滅菌時(shí)間，控制熱源，使處于15磅壓力保持30分鐘，即能達(dá)到*滅菌的目的，然后停止加溫。

(5)稍微打開(kāi)一點(diǎn)排氣活門，使鍋內(nèi)蒸氣緩慢排除，然后逐漸開(kāi)大活門，氣壓徐徐下降，注意勿使排氣過(guò)快，否則會(huì)使鍋內(nèi)的培養(yǎng)基沸騰而沖脫或沾濕棉花塞，但排氣太慢又使培養(yǎng)基在鍋內(nèi)，受高溫處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，這樣對(duì)培養(yǎng)基也是不利的。一般從排氣到打開(kāi)鍋蓋以10分鐘左右為好。

(6)當(dāng)壓力表指針降到零、鍋內(nèi)蒸氣*排盡時(shí)，打開(kāi)鍋蓋取出培養(yǎng)基，如需制備固體斜面培養(yǎng)基時(shí)，則應(yīng)趁熱將試管斜放在桌上，上面蓋上報(bào)紙以免落灰塵，冷卻后便可收起。 (7)最后將高壓滅菌器內(nèi)的剩余水排出。

(8)抽取上述滅菌的培養(yǎng)基，放入25℃溫箱中，48小時(shí)后不見(jiàn)雜菌生出，便證明培養(yǎng)基已達(dá)到滅菌目的，可以使用。

此外，有些培養(yǎng)基在經(jīng)高壓滅菌后，其營(yíng)養(yǎng)成分容易分解而失去使用價(jià)值，此時(shí)可采用間歇蒸氣滅菌法，即將培養(yǎng)基放入高壓滅菌器內(nèi)，加熱至100℃，保持1小時(shí)，每日滅菌一次，連續(xù)進(jìn)行三次，即可達(dá)到滅菌的目的，又不至使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)分解。

三、思考題

1培養(yǎng)基有哪幾種類別? 各有什么特點(diǎn)和用途?

2干熱滅菌和高壓蒸汽法適用范圍如何? 電熱烘箱和高壓鍋如何操作? 各有哪些使用注意事項(xiàng)?

3怎樣檢查培養(yǎng)基滅菌是否*? 關(guān)于微生物實(shí)驗(yàn)--培養(yǎng)基的配制和滅菌的思考題！急！ 2010-5-8 19:32 提問(wèn)者： 喜歡和愛(ài)123 |瀏覽次數(shù)：1520次 1.在一般情況下為什么試管或三角瓶培養(yǎng)基要用棉花塞而不用軟木塞或橡皮塞？ 2.高壓蒸汽滅菌過(guò)程中為什么一定要排放鍋內(nèi)的冷空氣？ 我來(lái)幫他解答 2010-5-8 19:58 滿意回答 1.棉花起到過(guò)濾、透氣的作用?。〔⑶颐藁ǖ拈_(kāi)頭大小是可以盡可能改變的，而不需要非得找到合適的軟木或橡皮塞！ 2.高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過(guò)加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸氣不能溢出，而增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100℃的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。 在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時(shí)，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否*極為重要，因?yàn)榭諝獾呐蛎泬捍笥谒羝呐蛎泬海?，?dāng)水蒸汽中含有空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。 滅菌更*！

常用培養(yǎng)基的制備、滅菌與消毒

2006-09-20 00:00:00來(lái)源：評(píng)論：0我要評(píng)論

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解培養(yǎng)基的配制原理；掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟；了解常見(jiàn)滅菌、清毒基本原理

及方法；掌握干熱天菌、高壓蒸汽滅菌及過(guò)濾除菌的操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理 培養(yǎng)基是人工按一定比例配制的供微生物生長(zhǎng)繁殖和合成代謝產(chǎn)物所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的原材…

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

了解培養(yǎng)基的配制原理；掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟；了解常見(jiàn)滅菌、清毒基本原理及方法；掌握干熱天菌、高壓蒸汽滅菌及過(guò)濾除菌的操作方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理

培養(yǎng)基是人工按一定比例配制的供微生物生長(zhǎng)繁殖和合成代謝產(chǎn)物所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的原材料可分為碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因素和水。根據(jù)微生物的種類和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，培養(yǎng)基也有不同的種類和配制方法。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用*泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有時(shí)又稱為普通培養(yǎng)基。由于這種培養(yǎng)基中含有一般細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需要的最基本的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以可供微生物生長(zhǎng)繁殖之用。

干熱天菌、高壓蒸汽滅菌方法主要是通過(guò)升溫使蛋白質(zhì)變性從而達(dá)到殺死微生物的效果。

1.滅菌鍋、pH度紙、棉花、牛皮紙、記號(hào)筆、麻繩、紗布、吸管、培養(yǎng)皿、電烘箱、注射器、微孔濾膜過(guò)濾器、鑷子等。

牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.稱量→溶化→調(diào)pH→過(guò)濾→分裝→加塞→包扎→滅菌→無(wú)菌檢查

2.干熱滅菌：裝入待滅菌物品→升溫→恒溫→降溫→開(kāi)箱取物

3.高壓蒸汽滅菌：加水→裝物品→加蓋→加熱→排冷空氣→加壓→恒壓→降壓回零→排汽→取物→無(wú)菌檢查

4.過(guò)濾除菌：組裝滅菌→連接→壓濾→無(wú)菌檢查→清洗滅菌

五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)

1.要嚴(yán)格按配方配制。

2.調(diào)pH不要過(guò)頭。

3.干熱滅菌要注意物品不要堆放過(guò)緊，注意溫度的時(shí)間控制，70oC以下放物、取物。

4.高壓滅菌要注意物品不要過(guò)多，加熱后排除冷空氣，到時(shí)降壓回零取物。

環(huán)節(jié)的操作技術(shù)與應(yīng)用。

（3） 學(xué)習(xí)并掌握培養(yǎng)基的高壓蒸氣滅菌原理、操作關(guān)鍵技術(shù)和滅菌技術(shù)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

培養(yǎng)基的制備原理

培養(yǎng)基是按照微生物生長(zhǎng)發(fā)育的需要，用不同組分的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)調(diào)制而成的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。人工制備培養(yǎng)基的目的，在于給微生物創(chuàng)造一個(gè)良好的營(yíng)養(yǎng)條件。把一定的培養(yǎng)基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的環(huán)境和場(chǎng)所。自然界中，微生物種類繁多，由于微生物具有不同的營(yíng)養(yǎng)類型，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同，加之實(shí)驗(yàn)和研究上的目的不同，所以培養(yǎng)基在組成原料上也各有差異。但是，不同種類和不同組成的培養(yǎng)基中，均應(yīng)含有滿足微生物生長(zhǎng)發(fā)育的水分、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和生長(zhǎng)素以及某些特需的微量元素等。此外，培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的酸堿度(pH值)和一定緩沖能力及一定的氧化還原電位和合適的滲透壓。

根據(jù)制備培養(yǎng)基對(duì)所選用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的來(lái)源，可將培養(yǎng)基分為天然培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基三類。按照培養(yǎng)基的形態(tài)可將培養(yǎng)基分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。根據(jù)培養(yǎng)基使用目的，可將培養(yǎng)基分為選擇培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基及鑒別培養(yǎng)基等。

培養(yǎng)基的類型和種類是多種多樣的，必須根據(jù)不同的微生物和不同的目的進(jìn)行選擇配制，本實(shí)驗(yàn)分別配制常用培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌和真菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基和馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等固體培養(yǎng)基。

固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中添加凝固劑制成的，常用的凝固劑有瓊脂、明膠和硅酸鈉，其中以瓊脂最為常用，其主要成份為多糖類物質(zhì)，性質(zhì)較穩(wěn)定，一般微生物不能分解，故用凝固劑而不致引起化學(xué)成份變化。瓊脂在95℃的熱水中才開(kāi)始融化，融化后的瓊脂冷卻到45℃才重新凝固。因此用瓊脂制成的固體培養(yǎng)基在一般微生物的培養(yǎng)溫度范圍內(nèi)(25℃-37℃)不會(huì)融化而保持固體狀態(tài)。

高壓蒸氣滅菌原理

高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過(guò)加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100℃的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。

在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：一是濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低(表Ⅴ-2)，二是濕熱的穿透力比干熱大(表Ⅴ-3)；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在100℃時(shí)，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可放出

2.26kJ(千焦)的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。

表Ⅴ-2 蛋白質(zhì)含水量與凝固所需溫度的關(guān)系

卵自蛋白含水量(%)

50

25

18

6

30分鐘內(nèi)凝固所需溫度(℃) 56 74-80 80-90 145 160-170

培養(yǎng)基的配制與滅菌實(shí)驗(yàn)報(bào)告

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