谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒(微板法)

 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒(微板法)

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1823

產(chǎn)品規(guī)格：100T

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-Px)是一種含硒的水溶性四聚體蛋白酶。幾平在所有組織中都有分布，在一些病理狀況下谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活力會(huì)發(fā)生明顯的變化，該酶可以清除活細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物，在保護(hù)細(xì)胞免受自由基損傷過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。細(xì)胞內(nèi)的脂類容易和自由基發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生脂類過(guò)氧化物。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶不僅具有消除自由基和衍生物的作用，還與過(guò)氧化氫酶(CAT)、磷脂氫過(guò)氧化物谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(PH-GSH-Px)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)構(gòu)成不同基質(zhì)特異性的多水平的還原有機(jī)氫過(guò)氧化物系統(tǒng)，減少脂質(zhì)過(guò)氧化物的形成，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化損傷能力。

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑盒(Glutathione Peroxidase AssayKit)是一種以過(guò)氧化氫為底物，通過(guò)微板法檢測(cè)細(xì)胞、組織或其它樣品中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的試劑盒。絕大部分細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶都是含硒的，且硒為該酶的活性中性組成部分。細(xì)胞內(nèi)也有棲少量的不含硒的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶存在。本試劑盒檢測(cè)的是最常見(jiàn)的含硒的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，該檢測(cè)法的缺點(diǎn)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶可以利用還原型谷胱甘肽(GSH)催化過(guò)氧化氫以及許多有機(jī)過(guò)氧化物，產(chǎn)生水或有機(jī)醇，在特殊情況下會(huì)影響檢測(cè)準(zhǔn)確性。硒是GSH-Px的必須組成部分，每分子該酶含有含有四分子硒，該酶的活性中心是硒半胱氨酸，測(cè)定該酶的活力可以衡量有機(jī)體硒水平。其檢測(cè)原理是：GSH-Px可催化谷胱甘肽(GSH)與苯甲酸顯色液發(fā)生氧化反應(yīng)，使之生成黃色陰離子，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)422nm處吸光度值測(cè)定該陰離子的濃度，間接推算GSH減少的量。本試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

產(chǎn)品組成：

自備材料：

1. 生理鹽水或PBS

2. 離心管、1.5mlEP管或96孔板

3. 酶標(biāo)儀

4. 水浴鍋或恒溫箱

5. 離心機(jī) 

 操作步驟(僅供參考):

1. 樣本處理:

a.血清、血漿樣本：從待測(cè)樣本中分離出的血清或血漿不應(yīng)有溶血，如果含有，應(yīng)去除紅細(xì)胞后檢測(cè)，如超過(guò)檢測(cè)范圍，用生理鹽水稀釋后檢測(cè)。血清去除紅細(xì)胞的簡(jiǎn)易方法如下:

用抗凝管收集血液，顛倒混勻。取至少500ul全血，4℃ 3000g離心5min。棄上清，用預(yù)冷的10倍體積的樣品勻漿液重懸紅細(xì)胞沉淀，再同前離心，棄上清。加入約4倍體積預(yù)冷的ddH2O裂解紅細(xì)胞沉淀， 12000 r/min 離心5min，取上清；亦可采用ACK紅細(xì)胞裂解液等去除紅細(xì)胞，取上清。

b.組織樣本：動(dòng)物用含有20U/ml heparin的生理鹽水(0.9%NaCl containing20U/ml heparin)灌流清除血液后獲取組織樣品。按照每20mg組織加入200ul樣品勻漿液的比例，用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿。4℃，12000g離心10min。取上清用于酶活性的測(cè)定。

c.細(xì)胞樣本：對(duì)于貼壁細(xì)胞，由于后續(xù)用于酶活性的測(cè)定，避免使用胰酶消化細(xì)胞?？梢允褂眉?xì)胞刮或EDTA處理細(xì)胞收集細(xì)胞。細(xì)胞用PBS或生理鹽水洗滌1次。按照每10⁶細(xì)胞加入300-500ul勻漿液的比例用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿，4℃12000g離心10min，取上清用于酶活性的測(cè)定。亦可采用Western及IP細(xì)胞裂解液參考相應(yīng)說(shuō)明裂解細(xì)胞樣品，按照每10⁶細(xì)胞加入100-200u1裂解液的比例進(jìn)行裂解，取上清用于酶活性的測(cè)定。

d.植物樣本：稱取0.2g新鮮樣品或-80℃凍存的樣品，放入預(yù)冷的研缽中，加入2ml 預(yù)冷的磷酸緩沖液(0.05M，pH7.0），在冰浴上研磨或勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，4℃ 12000r/min 離心10~15min，取上清，用于酶活性的測(cè)定。

2. GSH工作液的配制：取0.5ml ddH20加入15.4mgGSH中，充分溶解開(kāi)混勻，即獲得GSH儲(chǔ)存液(100mmol/L)，立即分裝后-20℃保存。取適量的GSH儲(chǔ)存液(100mmol/L)，按GSH配制液：GSH儲(chǔ)存液(100mmol/L)=99:1的比例稀釋至1mmol/L，即為GSH工作液(1mmol/L)，該溶液配制好以后可4℃保存1天。

3. 氧化工作液的配制：準(zhǔn)確取氧化劑0.1ml加入6.5ml ddH20，即為氧化儲(chǔ)存液(100×)，4℃保存。臨用前，準(zhǔn)確取氧化儲(chǔ)存液(100×)0.1ml加入6.5ml ddH2O，即為氧化儲(chǔ)存液 (100×)，4℃保存，臨用前準(zhǔn)確取氧化儲(chǔ)存液(100×)0.1ml 加入 9.9ml ddH2O，即為氧化工作液；4℃保存，1天有效。

4. GSH-Px酶促反應(yīng)：可參考下表設(shè)置檢測(cè)反應(yīng)體系，依次加入試劑：

5. GSH-Px顯色反應(yīng)：可參考下表設(shè)置檢測(cè)反應(yīng)體系，依次加入試劑：

6. GSH-Px測(cè)定：混勻，置于室溫孵育1min，以ddH2O調(diào)零，用酶標(biāo)儀檢測(cè)422nm處吸光度(即為A空白、A本底、A測(cè)定）；如果用酶標(biāo)儀96孔板每孔應(yīng)加250μl；如果用分光光度計(jì)，比色杯光徑應(yīng)為1cm，加入的量應(yīng)根據(jù)比色杯的最小量程而定；經(jīng)測(cè)定，一般情況下A空白在0.003~0.05之間，A本底在0.1~0.3左右。

計(jì)算:

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶酶活力單位的定義：排除非酶促反應(yīng)，在37℃，每1L血清，1min內(nèi)可以催化1μmol GSH 氧化所需(減少)的酶量為一個(gè)GSH-Px活性單位。

GSH-Px(U/L)=(A本底-A測(cè)定)/(A本底-A空白)×200

式中：A空白=空白對(duì)照的吸光度

A本底=本底對(duì)照的吸光度

A測(cè)定=待測(cè)樣品的吸光度

200=1000(ml)/5(min)

注：a、[檢測(cè)體系中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力的單位為U/L=mU/ml。

b、樣品(如組織樣本)中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力=[檢測(cè)體系中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力]×稀釋倍數(shù)/樣品中的蛋白濃度]

[樣品中(如組織樣本)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力]的單位為:U/mg或mU/mg蛋白樣品中的蛋白濃度1的單位為:mg/ml。

c、計(jì)算示例：樣品的蛋白濃度經(jīng)測(cè)定為05mg/ml，稀釋2倍后進(jìn)行測(cè)定。一般情況下，A空白在0.003~0.05之間，A本底在0.10~0.3左右。如果A本底＝0.30，A測(cè)定＝0.20，A空白＝0.003 那么:

液體樣本 GSP-Px活力=(0.30-0.2)/(0.30-0.003)×200×2=134.7U/L

組織樣本 GSP-Px活力=134.7U/L×2/(0.5mg/ml)=538.8mU/mg(蛋白)

參考區(qū)間：成年人血清GSP-Px：115~140 U /L

注意事項(xiàng)：

1. 上述低溫試劑避免反復(fù)凍融，以免失效或效率下降。

2. 本法中所有氧化劑或還原劑都會(huì)干擾本試劑盒的測(cè)定，如果在樣品中的還原劑無(wú)法避免，例如DTT、巰基乙醇等，則這些還原劑的總濃度至少低于0.1mM；0.15mM的DTT可以抑制 40%的酶活力。

3. 常用的 Triton X-100、Tween 20等去垢劑都含有較高水平的過(guò)氧化物，會(huì)影響本試劑盒的測(cè)定，如果必須使用這些去垢劑，最好使用純度較高并注明含較低濃度過(guò)氧化物的去垢劑。

4. 樣品取出后最好立即測(cè)定，也可以-80℃凍存待以后測(cè)定。

5. 一定要嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)的溫度，否則會(huì)引起較多誤差。

有效期：12個(gè)月有效。