谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒(比色法)

 谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒(比色法)

產品貨號：BA1824

產品規(guī)格：50T/100T

產品簡介：

谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-Px)是一種含硒的水溶性四聚體蛋白酶。幾平在所有組織中都有分布，在一些病理狀況下谷胱甘肽過氧化物酶的活力會發(fā)生明顯的變化，該酶可以清除活細胞內過氧化物，在保護細胞免受自由基損傷過程中起著關鍵作用。細胞內的脂類容易和自由基發(fā)生反應，產生脂類過氧化物。谷胱甘肽過氧化物酶不僅具有消除自由基和衍生物的作用，還與過氧化氫酶(CAT)、磷脂氫過氧化物谷胱甘肽過氧化物酶(PH-GSH-Px)、谷胱甘肽S轉移酶(GST)構成不同基質特異性的多水平的還原有機氫過氧化物系統，減少脂質過氧化物的形成，增強機體抗氧化損傷能力。

谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒(Glutathione Peroxidase AssayKit)是一種以過氧化氫為底物，通過比色法檢測細胞、組織或其它樣品中谷胱甘肽過氧化物酶活性的試劑盒。絕大部分細胞內的谷胱甘肽過氧化物酶都是含硒的，且硒為該酶的活性中性組成部分。細胞內也有棲少量的不含硒的谷胱甘肽過氧化物酶存在。本試劑盒檢測的是最常見的含硒的谷胱甘肽過氧化物酶，該檢測法的缺點谷胱甘肽過氧化物酶可以利用還原型谷胱甘肽(GSH)催化過氧化氫以及許多有機過氧化物，產生水或有機醇，在特殊情況下會影響檢測準確性。硒是GSH-Px的必須組成部分，每分子該酶含有含有四分子硒，該酶的活性中心是硒半胱氨酸，測定該酶的活力可以衡量有機體硒水平。其檢測原理是:GSH-Px可催化谷胱甘肽(GSH)與苯甲酸顯色液發(fā)生氧化反應，使之生成黃色陰離子，通過分光光度計或酶標儀檢測422nm處吸光度值測定該陰離子的濃度，間接推算GSH減少的量。本試劑盒僅用于科研領域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

產品組成：

自備材料：

1. 生理鹽水或PBS

2. 離心管、小試管或96孔板

3. 分光光度計或酶標儀

4. 水浴鍋或恒溫箱

5. 離心機 

操作步驟(僅供參考):

1. 樣本處理:

a.血清、血漿樣本：從待測樣本中分理出的血清或血漿不應有溶血，如果含有應去除紅細胞后，直接檢測，如超過檢測范圍，用生理鹽水稀釋后檢測。血清去除紅細胞的簡易方法如下:

用抗凝管收集血液，顛倒混勻。取至少500ul全血，4℃ 3000g離心5min。棄上清，用冰冷的紅細胞沉淀10倍體積的樣品勻漿液重懸沉淀，再同前離心，棄上清。加入約紅細胞沉淀4倍體積的冰冷的ddH20裂解紅細胞。12000g離心5min，取上清。亦可采用紅細胞裂解液去除紅細胞，如ACK紅細胞裂解液等。

b.組織樣本：動物用含有20U/ml heparin的生理鹽水(0.9%NaCl containing20U/ml heparin)灌流清除血液后獲取組織樣品。按照每20mg組織加入200ul樣品勻漿液的比例，用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿。4℃，12000g離心10min。取上清用于酶活性的測定。

c.細胞樣本：對于貼壁細胞，由于后續(xù)用于酶活性的測定，避免使用胰酶消化細胞?？梢允褂糜眉毎位?/span>EDTA處理細胞收集細胞。細胞用無菌的PBS或生理鹽水洗滌1次。按照每10⁶細胞加入300-500ul勻漿液的比例用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿，4℃12000g離心10min，取上清用于酶活性的測定。亦可采用Western及IP細胞裂解液參考相應說明裂解細胞樣品，按照每10⁶細胞加入100-200u1裂解液的比例進行裂解，取上清用于酶活性的測定。

2. GSH工作液的配制：取0.5ml ddH20加入15.4mgGSH或1.0ml ddH20加入30.8mg GSH中，充分溶解開混勻，即獲得GSH儲存液(100mmol/L)，立即分裝后-20℃保存。取適量的GSH儲存液(100mmol/L)，按GSH配制液：GSH儲存液(100mmol/L)=99:1的比例稀釋至1mmol/L，即為GSH工作液(1mmol/L)，該溶液配制好以后可4℃保存1天。

3. 氧化工作液的配制：準確取氧化劑0.1ml加入6.5ml ddH20，即為氧化儲存液(100×)，4℃保存。臨用前，準確取氧化儲存液(100×)0.1ml加入10ml ddH2O，即為氧化工作液，4℃保存，1天有效。

4. GSH-Px酶促反應：可參考下表設置檢測反應體系，依次加入試劑：

5. GSH-Px顯色反應：可參考下表設置檢測反應體系，依次加入試劑：

②混勻，置于室溫孵育1min。以ddH20調零，用分光光度計或酶標儀檢測422nm處吸光度值，定義為A空白、A本底、A測定。如果用分光光度計，比色杯光徑應為1cm加入的上清量因根據比色杯的最小量程而定；如果用酶標儀，96 孔板每孔應加250ul上清液。

計算:

谷胱甘肽過氧化物酶酶活力單位的定義：1個酶活力單位(lunit)是指在37℃，每1L血清，排除非酶促反應，lmin內可以催化1umo/LGSH氧化所需(減少)的酶量為一個GSH-Px活性單位。

GSH-Px(U/L)=(A本底-A測定-A空白)/(A本底-A空白)×200

注：a、[檢測體系中谷胱甘肽過氧化物酶活力的單位為U/L=mU/ml。

b、「樣品(如組織樣本)中谷胱甘肽過氧化物酶活力1=[檢測體系中谷胱甘肽過氧化物酶活力]×稀釋倍數/樣品中的蛋白濃度]

[樣品中(如組織樣本)谷胱甘肽過氧化物酶活力]的單位為:U/mg或mU/mg蛋白樣品中的蛋白濃度1的單位為:mg/ml。

c、計算示例：樣品的蛋白濃度經測定為05mg/ml，稀釋2倍后進行測定。如果A本底=030，A測定=0.20，A空白=0.003 那么：

檢測體系中谷胱甘肽過氧化物酶活力=(0.30-0.02-0.003)/(0.30-0.003)×200×2=130.6U/L

樣品中谷胱甘肽過氧化物酶活力=130.6U/L×2/(0.5mg/ml)=522.4mU/mg(蛋白)

式中：A空白=空白對照的吸光度值

A本底=本底對照的吸光度值

A測定=待測樣品的吸光度值