植物總RNA快速提取試劑盒的使用說明

植物總RNA快速提取試劑盒

產(chǎn)品貨號：26125

產(chǎn)品規(guī)格：20T/50T

產(chǎn)品簡介：

本試劑盒采用的方法改變傳統(tǒng)一次性裂解的作法，對材料連續(xù)進行兩次裂解，并確保RNA不被降解，有效地解離核蛋白與核酸的復合物。使用本試劑盒能在2h內(nèi)完成RNA的提取工作，并得到質(zhì)量較高的產(chǎn)品，通過瓊脂糖凝膠電泳可以直觀地看到，條帶清晰，不拖尾。

本試劑盒可從植物組織(農(nóng)作物、水果、花草)中，快速提取總RNA，可同時處理大量不同樣品。提取的總RNA純度高，基本沒有基因組、蛋白和其它雜質(zhì)的污染，可用于RT-PCR、Real Time RT- PCR、芯片分析、Northern Blot、Dot Blot、PolyA篩選、體外翻譯、RNase保護分析和分子克隆等多種下游實驗。

產(chǎn)品組成：

本試劑盒在室溫儲存12個月不影響使用效果。

儲存事項：

1. 不合適的儲存于低溫(4℃或者-20℃) 會造成溶液沉淀， 影響使用效果，因此運 輸和儲存均在室溫下(15-25℃)進行。

2. 避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、PH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時蓋緊蓋子。

預防RNase污染：

1. 經(jīng)常更換新手套。因為皮膚經(jīng)常帶有細菌，可能導致RNase污染。

2. 使用無RNase的塑料制品和槍頭避免交叉污染。

3. RNA在裂解液SL中時不會被RNase降解。但提取后繼續(xù)處理過程中應(yīng)使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。

4. 配制溶液應(yīng)使用RNase-Free ddH₂O。(將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.1%(VNV)，混勻后放置過夜，高壓滅菌。)

操作步驟 (僅供參考) ：

注：所有相關(guān)器皿耗材都應(yīng)為RNase-free產(chǎn)品，操作過程要小心，帶口罩、手套避免環(huán)境中RNA酶污染樣品。

1. 取試驗材料放入研缽加入液氮快速研磨成粉末狀，分裝于1.5ml新的無RNase離心管中，每管約加材料50-100mg。

2. 迅速加入600μl RNA裂解液Ⅰ。

3. 渦旋震蕩混勻后再加入200μl分離液和200μl去蛋白液，振蕩至混勻。

4. 冰上平放靜置5min，4℃ 12000r/min離心10min。

5. 取約700μl上清液轉(zhuǎn)入新的無RNase離心管后加入500μl RNA裂解液Ⅱ。

6. 振蕩混勻后冰上平放靜置5min，4℃ 12000r/min離心5min。

7. 取約700μl上清液轉(zhuǎn)入新的無RNase離心管，加350μl緩沖液，搖晃混勻，再加入350μL去蛋白液，震蕩混勻。

8. 4℃ 12000r/min離心10min。

9. 取約700μl上清液轉(zhuǎn)入新的無RNase離心管并加入等體積的提取液，溫和混勻后室溫放置10min。

10. 4 ℃ 12000r/min離心10min，小心倒掉上清。

11. 加入500μl洗滌液，4℃ 12000r/min離心1min。

12. 小心倒掉上清，風干殘留液體，加入30~50μl RNase-Free ddH2O溶解沉淀。

13. 得到RNA溶液并于-70 ℃保存。

RNA得率：

RNA純度及濃度檢測：

完整性: RNA可用普通瓊脂糖凝膠電泳由于細胞中70-80%的RNA為rRNA，電泳后UV下應(yīng)能看到非常明顯的rRNA條帶。rRNA大小分別約為5kb和2kb,分別相當于28S和18S rRNA；植物RNA樣品中最大rRNA亮度應(yīng)為次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否則表示RNA樣品的降解。出現(xiàn)彌散片狀或條帶消失表明樣品嚴重降解。

純度:  OD₂₆₀/OD₂₈₀比值是衡量蛋白質(zhì)污染程度的指標。高質(zhì)量的RNA，OD₂₆₀/OD₂₈₀讀數(shù)在1.8-2.1之間，比值為2.0是高質(zhì)量RNA的標志。OD₂₆₀/OD₂₈₀讀數(shù)受測定所用溶液的pH值影響。同一個RNA樣品，假定在10mM Tris，pH7 .5溶液中測出的OD₂₆₀/OD₂₈₀讀數(shù)1.8-2.1之間，在水溶液中所測讀數(shù)則可能在1.5-1.9之間，但這并不表示RNA不純。

濃度: 取一定量的RNA提取物，用RNase-Free ddH₂O稀釋n倍，用RNase-FreeddH₂O將分光光度計調(diào)零，取稀釋液進行OD₂₆₀，OD₂₈₀測定，按照以下公式進行RNA濃度的計算。
           終濃度(ng/μl) = (OD₂₆₀)× (稀釋倍數(shù)n)×40

注意事項：

1. 所有的離心步驟均在4攝氏度下進行，使用轉(zhuǎn)速可以達到13,000 rpm的傳統(tǒng)臺式離心機，如Eppendorf 5415C或者類似離心機。

2. 需要自備研缽。

3. 裂解液Ⅰ和去蛋白液中含有刺激性化合物，操作時戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

4. 關(guān)于DNA的微量殘留：
一般說來任何總RNA提取試劑在提取過程中無法wan全避免DNA的微量殘留 (DNase消化也無法做到10%無殘留)，本公司的 RNA提取產(chǎn)品，由于采取了本公司du特的緩沖體系和基因組DNA清除技術(shù)，絕大多數(shù)DNA已經(jīng)被清除，不需要DNase消化，可直接用于反轉(zhuǎn)錄PCR和熒光定量PCR。個別特殊情況如DNA含量過于豐富造成殘留或者要進行嚴格的mRNA表達量分析熒光定量PCR，我們建議在進行模板和引物的選擇時:
1)選用跨內(nèi)含子的引物，以穿過mRNA中的連接區(qū)，這樣DNA就不能作為模板參與擴增反應(yīng)。
2)選擇基因組DNA和cDNA上擴增的產(chǎn)物大小不一樣的引物對。