Annexin V PE/7-AAD 凋亡檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

Annexin V PE/7-AAD 凋亡檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品貨號(hào): BA1984

產(chǎn)品規(guī)格: 20T/50T/100T

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。PS是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對(duì)稱(chēng)性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外。Annexin V具有易于結(jié)合到磷脂類(lèi)如PS 的特性，對(duì)PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞膜表面的PS。PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了。因此，可以采用AnnexinV與7-AAD雙染的方法，通過(guò)流式檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡。

產(chǎn)品組成：

操作步驟（僅供參考）：

1. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：

a) 對(duì)于貼壁細(xì)胞：小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用。用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，至細(xì)胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來(lái)時(shí)，加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞。再次收集到離心管內(nèi)。1000rpm左右離心5min，沉淀細(xì)胞。對(duì)于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞無(wú)法離心至離心管底，可以適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清；

b) 對(duì)于懸浮細(xì)胞：1000rpm左右離心5min，沉淀細(xì)胞。對(duì)于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞無(wú)法離心管底，可以適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清；

2. 用去離子水按1:3稀釋結(jié)合緩沖液(4ml 4×結(jié)合緩沖液+12ml去離子水)；

3. 用1×結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1-5×10⁶ /ml；

4. 取100µl的細(xì)胞懸液于5ml流式管中，加入5µl Annexin V/PE混勻后于室溫避光孵育5分鐘；

5. 加入10µl 20ug/ml的7AAD，并加400µl PBS，立刻進(jìn)行流式檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

1）未轉(zhuǎn)染細(xì)胞

空白管：陰性對(duì)照組細(xì)胞，不加Annexin V/PE，7AAD，用于調(diào)節(jié)電壓。

單染管：陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞，只加Annexin V/PE或只加7AAD，用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。

檢測(cè)管：處理的細(xì)胞，加Annexin V/PE，7AAD。用空白管和單染管調(diào)節(jié)好電壓補(bǔ)償后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。 2）轉(zhuǎn)染GFP

未轉(zhuǎn)染空白管：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，不加Annexin V/PE，7AAD，用于調(diào)節(jié)電壓。

未轉(zhuǎn)染單染管：未轉(zhuǎn)染且有明顯凋亡的細(xì)胞，只加Annexin V/PE或只加7AAD，用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。

轉(zhuǎn)染GFP空白管：轉(zhuǎn)染GFP對(duì)照組細(xì)胞，不加Annexin V/PE，7AAD，用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。

檢測(cè)管：處理的細(xì)胞，加Annexin V/PE，7AAD。調(diào)節(jié)好電壓補(bǔ)償后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。

注意事項(xiàng):

1. Annexin V是與磷脂酰絲氨酸(PS)親和，而PS在不同種屬間沒(méi)差異。在正常細(xì)胞中，PS只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。

2. 低濃度胰酶消化，輕柔吹打貼壁細(xì)胞2～3次，離心機(jī)4℃1000rpm 5min離心，處理得當(dāng)?shù)脑?huà)，胰酶造成損傷可以控制在5%以?xún)?nèi)，有對(duì)照組的情況下對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不會(huì)造成明顯影響。

3. 先加PI不僅染色是否每組都均勻充分很難判斷，而且PI本身對(duì)細(xì)胞也是有毒性的，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響會(huì)比胰酶大，不建議這樣做。

4. Annexin V是Ca依賴(lài)的蛋白，所以不能加入EDTA，防止EDTA螯合了Ca離子從而影響Annexin V，進(jìn)而影響結(jié)果。

5. 用流式檢測(cè)凋亡時(shí)，7AAD受時(shí)間的影響很大，因標(biāo)記了7AAD后會(huì)加大細(xì)胞毒性，隨著時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致7AAD的染色增加，特別是檢測(cè)早期凋亡時(shí)，如果時(shí)間延長(zhǎng)除了會(huì)導(dǎo)致在流式細(xì)胞儀上的細(xì)胞分群差距加大外，誤差會(huì)明顯加大。一般7AAD加上后立刻上機(jī)，然后在一個(gè)小時(shí)內(nèi)檢測(cè)完成。兩種方法都可以，但是按照我們操作步驟造成的誤差會(huì)更小。

保存條件：2-8℃避光，勿冷凍。6個(gè)月有效。