γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）活性檢測(cè)試劑盒 （可見(jiàn)分光光度法）

γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）活性檢測(cè)試劑盒

（可見(jiàn)分光光度法）

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1031

產(chǎn)品規(guī)格：50管/24樣

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：液體40mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存。臨用前加14mL蒸餾水充分震蕩溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1支，4℃保存。臨用前加3.5mL蒸餾水充分震蕩溶解。

試劑四：液體16mL×1瓶，4℃保存。

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入30mL蒸餾水，充分震蕩溶解后，緩緩加入1.0mL濃硫酸（自備），邊加邊攪拌。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體1mL×1支，4℃保存。1μmol/mL磷標(biāo)準(zhǔn)溶液。

產(chǎn)品說(shuō)明：

GCL（glutamate cysteine ligase）是GSH合成的限速酶，GSH對(duì)GCL有反饋抑制作用。GCL基因表達(dá)受多種因素調(diào)節(jié)，如氧化劑、抗氧化劑、生長(zhǎng)因子和炎癥因子等。GCL活性高低對(duì)GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影響。

在ATP和Mg²⁺存在下，GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同時(shí)ATP去磷酸化產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷分子，通過(guò)測(cè)定無(wú)機(jī)磷增加速率，即可計(jì)算出GCL活性。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、冷凍離心機(jī)、水浴鍋、移液器、1mL玻璃比色皿、濃硫酸和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3. 血清等液體：直接測(cè)定。

二、GCL測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到660nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 將標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋成0.1μmol/mL 磷標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3. 加樣表：

三、GAL活性計(jì)算： 

（1）按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃下，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的GCL酶活量為1個(gè)酶活力單位。

GCL（U/mg prot）=[ΔA測(cè)÷（ΔA標(biāo)÷C標(biāo)準(zhǔn)液）×V反總]÷(Cpr×V樣)÷T

=0.0544×ΔA測(cè)÷ΔA標(biāo)÷Cpr

（2）按樣品鮮重計(jì)算

活性單位定義：37℃下，每克樣品每分鐘催化產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的GCL酶活量為1個(gè)酶活力單位。

GCL（U/g鮮重）=[ΔA測(cè)÷（ΔA標(biāo)÷C標(biāo)準(zhǔn)液）×V反總]÷(W÷V樣總×V樣)÷T

=0.0544×ΔA測(cè)÷ΔA標(biāo)÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：37℃下，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的GCL酶活量為1個(gè)酶活單位。

GCL（U/10⁴ cell）=[ΔA測(cè)÷（ΔA標(biāo)÷C標(biāo)準(zhǔn)液）×V反總]÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=0.0544×ΔA測(cè)÷ΔA標(biāo)÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按照液體體積計(jì)算

活性單位定義：37℃下，每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的GCL酶活量為1個(gè)酶活單位。

GCL（U/mL）= [ΔA測(cè)÷（ΔA標(biāo)÷C標(biāo)準(zhǔn)液）×V反總]÷V樣÷T

=0.0544×ΔA測(cè)÷ΔA標(biāo)

V反總：反應(yīng)總體積，0.98mL；V樣：加入樣品體積，0.12mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；T：反應(yīng)時(shí)間，15min，C標(biāo)準(zhǔn)液：磷標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，0.1μmol/mL；V樣總：加入試劑一的體積，1mL；W：樣品鮮重，g；細(xì)胞數(shù)量：以10⁴為單位計(jì)算，萬(wàn)個(gè)。

注意事項(xiàng)： 

（1）樣品處理等過(guò)程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力，以免影響其活力。如果是勻漿液，避免反復(fù)凍融。

（2）樣本測(cè)定前先取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如吸光值大于1，應(yīng)先用試劑一(或者生理鹽水)稀釋到適當(dāng)倍數(shù)，哺乳動(dòng)物組織和血液一般稀釋3～5倍。

（3）細(xì)胞中GCL活性測(cè)定時(shí)，細(xì)胞數(shù)目須在300萬(wàn)-500萬(wàn)之間，細(xì)胞中GCL的提取時(shí)可加試劑一（或生理鹽水）后研磨或超聲波處理，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞。

（4）試劑三配制完成后，請(qǐng)一周內(nèi)使用完。

（5）試劑五配制過(guò)程中，可能會(huì)產(chǎn)生黑色固體，其不影響結(jié)果，注意吸取時(shí)不要將黑色固體吸入。該溶液配制完成后應(yīng)為淺黃色，若為藍(lán)色則已污染，不可再使用。

（6）測(cè)定吸光值時(shí)請(qǐng)于水浴后10～40分鐘內(nèi)測(cè)完。