細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒 返回列表頁

產(chǎn)品名稱：細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒

產(chǎn)品貨號：26121

產(chǎn)品包裝：50 次/100 次/200 次

產(chǎn)品簡介：

在研究細(xì)胞時經(jīng)常要研究細(xì)胞的不同組份，而研究得多的兩個細(xì)胞組份就是細(xì)胞核和細(xì)胞漿。分離細(xì)胞核 蛋白和細(xì)胞漿蛋白，不僅可以用于研究蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位，而且很多時候分離出來的核蛋白可以用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控 方面的研究，例如 EMSA(也稱 gel shift)，footprinting 等。

細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一種比較簡單、方 便的從培養(yǎng)細(xì)胞或新鮮組織中抽提細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白的方法。約 90 分鐘就可以完成培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核蛋 白與細(xì)胞漿蛋白的分離。抽提得到的蛋白可以用于 Western，EMSA，footprinting，報告基因檢測以及酶活力測定 等后續(xù)操作。

  本試劑盒是通過細(xì)胞漿蛋白抽提試劑 A 和 B，在低滲透壓條件下，使細(xì)胞充分膨脹，然后破壞細(xì)胞膜，釋放 出細(xì)胞漿蛋白，然后通過離心得到細(xì)胞核沉淀。后通過高鹽的細(xì)胞核蛋白抽提試劑抽提得到細(xì)胞核蛋白。

產(chǎn)品組成：

試劑名稱 50 次 100 次 200 次 保存條件 Wash Buffer 50mL 100ml 200ml 室溫 Cytoplasmic Extract Buffer 10mL 20ml 40ml 4℃ CE Buffer 5mL 10ml 20ml 4℃ Nuclear Extract Buffer 2.5mL 5ml 10ml 4℃ High Salt Solution 8mL 16ml 32ml 室溫 DTT 溶液 0.25mL 0.5ml 1ml -20℃

操作步驟（僅供參考）：

核蛋白與胞漿蛋白抽提

(以下步驟以 4×10 7 個細(xì)胞為例，具體實驗所需量可根據(jù)細(xì)胞數(shù)減倍)

1. 收集 4×10 7 個細(xì)胞于 1.5mL 離心管中，用 1mL Wash Buffer 輕輕吹勻，1000rpm 離心去上清。估算所收集細(xì) 胞體積（Packed Cell Volume，PCV），通常情況每 4×10 7 細(xì)胞 PCV = 20μL

2. 加入 5 倍 PCV 體積（約 100μL）Cytoplasmic Extract Buffer，用移液器輕輕吹勻。

3. 冰上孵育 3min，4℃ 10000 rpm 離心 4min。

4. 用移液器輕輕收集上清（切勿觸及沉淀），所提即為細(xì)胞胞漿蛋白。

5. 于沉淀中加入用 5 倍 PCV 體積（約 100μL）Cytoplasmic Extract Buffer，用移液器輕輕吹起，4℃ 12000-14000 rpm 離心 5min，吸棄上清。

6. 于沉淀中加入 100μL CE Buffer，用移液器輕輕吹起沉淀。

7. 加入一倍沉淀體積 Nuclear Extract Buffer（約 50μL），此時離心管內(nèi)總體積約 200μL。

8. 加入 35μL High Salt Solution，渦旋并用移液器重懸沉淀。

9. 冰上孵育 10min，每隔 2min 渦旋并重懸沉淀。

10. 4℃ 12000-14000 rpm 離心 10min。

11. 立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細(xì)胞核蛋白?？梢粤⒓词褂茫部梢?70℃凍存。

12. 對于新鮮組織核蛋白與胞漿蛋白的抽提

a. 稱取 30-50mg 組織，把組織盡可能切成非常細(xì)小的碎片，并將組織塊用 1mL Wash Buffer 潤洗，4℃ 1000rpm 離心 3min，吸棄溶液。

b. 將組織加入并轉(zhuǎn)移至勻漿器中，加入 1mL Wash Buffer 及 200μL Cytoplasmic Extract Buffer。

c. 在玻璃勻漿器內(nèi)充分勻漿。勻漿需在冰浴或 4℃進(jìn)行。

d. 勻漿后把勻漿液轉(zhuǎn)移到塑料離心管內(nèi)，冰浴放置 15 分鐘。

e. 4℃10000rpm 離心 5 分鐘。把上清轉(zhuǎn)移至新離心管中，為抽提得到的部分細(xì)胞漿蛋白。(吸上清時千萬不要觸及 沉淀)

f. 對于沉淀，到了這一步已經(jīng)充分勻漿，但很多細(xì)胞還沒有破碎。按照使用說明的步驟 2 開始操作，即把沉淀當(dāng) 做已經(jīng)離心收集好的細(xì)胞沉淀操作，按照步驟 2 至步驟 11 抽提得到細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白。抽提得到的細(xì)胞 漿蛋白可以和步驟 12e 中抽提得到的細(xì)胞漿蛋白合并?？梢粤⒓词褂?，也可以-70℃凍存。

注意事項：

1. 如需提取磷酸化蛋白請在抽提試劑 Cytoplasmic Extract Buffer/CE Buffer/Nuclear Extract Buffer 中加入磷酸酶 抑制劑。

2. 所有樣品操作請置于冰上進(jìn)行。

3. 如所提蛋白濃度較低，可按比例縮小所用溶液體積比例

4. 本試劑盒對于組織樣品，僅適合于新鮮組織，對凍存過的組織抽提效果很差。

5. 使用本試劑盒抽提到的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白均可直接用本公司生產(chǎn)的 BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋 白濃度。但不適合用 Bradford 法測定蛋白濃度。

6. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

7. 使用前請于 Cytoplasmic Extract Buffer 中加入 0.4mL DTT 溶液，于 CE Buffer 中加入 0.2mL DTT 溶液。

8. 可根據(jù)實際需要增加 Cytoplasmic Extract Buffer 量，以充分裂解。

保存條件：

-20℃保存，一年有效。