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乙醇酸氧化酶活性檢測(cè)試劑盒（微量法）

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1436

產(chǎn)品規(guī)格：100管/96樣

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

乙醇酸氧化酶（EC1.1.3.15）是乙醇酸循環(huán)中的一種酶，也是植物光呼吸代謝中的關(guān)鍵酶，催化乙醇酸氧化生 成乙醛酸，通過測(cè)定乙醇酸氧化酶活性，可以了解植物光合和呼吸代謝的基本方法。 乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，乙醛酸和鹽酸苯肼反應(yīng)生成乙醛酸苯腙，在324nm有特征吸收峰。 注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者 增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

產(chǎn)品組成：

溶液的配制：

1.        試劑二：臨用前加入2.5mL雙蒸水溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、微量石英比色皿/96孔板UV板、天平、研缽/勻漿器、 冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g 組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃，離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

細(xì)胞或細(xì)菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1.        紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至324nm，紫外分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2.        將試劑一25℃預(yù)熱15min。

3.        樣本測(cè)定：在微量石英比色皿/96孔UV板中分別加入下列試劑：

GO酶活計(jì)算

1.  按微量石英比色皿計(jì)算：

（1）按蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘生成1nmol乙醛酸苯肼所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

GO酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×Cpr）÷T=392.16×ΔA÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：每克組織每分鐘生成1nmol乙醛酸苯肼所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

GO 酶活（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×W÷V樣總）÷T=392.16×ΔA÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：每萬細(xì)胞每分鐘生成1nmol乙醛酸苯肼所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

GO酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×500÷V樣總）÷T=0.784×ΔA

ε：乙醛酸苯腙毫摩爾消光系數(shù)：17000L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)總體積，2×10^-4L；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測(cè)定；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，3min；500：500萬個(gè)細(xì)胞；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

2.  按96孔UV板計(jì)算：

將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm（96孔UV板光徑）進(jìn)行計(jì)算即可。

注意事項(xiàng)：

1.        測(cè)定之前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，若吸光值A1>1，請(qǐng)將樣本用提取液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂屧贉y(cè)定，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

2.        色素含量較高的樣本，可在提取酶時(shí)加活性炭吸附。

3.        空白管為檢測(cè)各試劑組分質(zhì)量的檢測(cè)孔，正常情況下，其OD值變化不超過0.02。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1.        稱取約0.1g三葉草組織，加入1mL提取液，進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃，離心10min，取上清進(jìn)行檢測(cè)，使用微量石英比色皿測(cè)得ΔA測(cè)定管=A2測(cè)定-A1測(cè)定=0.8956-0.7839=0.1117，ΔA空白管=A2空白-A1空白=0.0853-0.077=0.0083，ΔA=ΔA測(cè)定管-ΔA空白管=0.1117-0.0083=0.1034，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：GO酶活（U/g 質(zhì)量）=392.16×ΔA÷W=405.4934 U/g 質(zhì)量。

2.        稱取約0.1g菠菜組織，加入1mL提取液，進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃，離心10min，取上清稀釋2倍進(jìn)行檢測(cè)，使用微量石英比色皿測(cè)得ΔA測(cè)定管=A2測(cè)定-A1測(cè)定=0.9286-0.8105=0.1181，ΔA空白管=A2空白-A1空白=0.0853-0.077=0.0083，ΔA=ΔA測(cè)定管-ΔA空白管=0.1181-0.0083=0.1098，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：GO酶活（U/g質(zhì)量）=392.16×ΔA÷W×2（稀釋倍數(shù)）=861.1834 U/g質(zhì)量。