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漆酶活性檢測試劑盒（可見分光光度法）

注意：正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定。

產(chǎn)品貨號：BA1256

產(chǎn)品規(guī)格：50管/48樣

產(chǎn)品簡介：

漆酶（CE1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶，屬于銅藍(lán)氧化酶家族，漆酶存在菇、菌及植物中，是一種環(huán)保型酶，其*的催化性質(zhì)在生物檢測中有廣泛的應(yīng)用。

漆酶分解底物ABTS產(chǎn)生ABTS自由基，在420nm處的吸光系數(shù)遠(yuǎn)大于底物ABTS，測定ABTS自由基的增加速率，可計算得漆酶活性。

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體50mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×2瓶，4℃避光保存。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、低溫離心機(jī)、1mL玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、天平、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水，水浴鍋。

操作步驟：

一、粗酶液提取：

（1）組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

（2）細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測。

（3）培養(yǎng)液：直接檢測。

二、測定步驟：

1、 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至420nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 水浴鍋溫度調(diào)至45℃。

3、 工作液的配制：一瓶試劑二用25mL試劑一溶解?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

4、 操作表：在1mL玻璃比色皿中分別加入下列試劑：

三、漆酶活計算：

（1）按蛋白濃度計算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶酶活（U/mg prot）=△A÷ε÷d×V反總×10⁹÷（V樣×Cpr）÷T= 61.7×△A÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：每克樣品每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶酶活（U/g 鮮重）=△A÷ε÷d×V反總×10⁹÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 61.7×△A÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計算

酶活定義：每10⁴個細(xì)胞每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶酶活（U/10⁴ cell）=△A÷ε÷d×V反總×10⁹÷（V樣×500÷V樣總）÷T= 0.123×△A

（4）按液體體積計算

酶活定義：每mL液體每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶酶活（U/mL）=△A÷ε÷d×V反總×10⁹÷V樣÷T= 61.7×△A

ε：ABTS 摩爾消光系數(shù)：36000L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.001L；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.15mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度需自行測定；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，3min。

注意事項：

1、工作液需臨用前配制，并且盡快使用，4℃保存一周，若變色則不能使用。

2、測定之前進(jìn)行預(yù)實驗，若吸光值較高，請將樣品用提取液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂屧贉y定，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

3、空白管為檢測各試劑組分質(zhì)量的檢測孔，正常情況下，OD值變化不超過0.05。