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羥脯氨酸（HYP）含量檢測試劑盒（微量法）

注意：正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定。

產(chǎn)品貨號：BA1253

產(chǎn)品規(guī)格：100管/96樣

產(chǎn)品簡介：

HYP是機體膠原蛋白主要成分之一，膠原蛋白大多分布于皮膚、腱、軟骨和血管等，因此HYP含量是反映膠原組織代謝及纖維化程度的一項重要指標。

樣品經(jīng)酸水解產(chǎn)生游離的HYP，進一步被氯胺T氧化，氧化產(chǎn)物與對二甲氨基甲醛反應，產(chǎn)生紅色化合物，在560nm處有特征吸收峰。通過測定樣品水解液560nm吸光值，可計算HYP含量。

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：6mol/L鹽酸，自備。濃鹽酸：H₂O（V/V）= 1:1，室溫保存。

試劑一：液體8mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑二：液體8mL×1瓶，4℃避光保存。

標準品：液體0.5mL×1支，0.5mg/mL羥脯氨酸標準品，4℃保存。

需自備的儀器和用品：

天平、烘箱、玻璃管、離心機、水浴鍋、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、6mol/L鹽酸和蒸餾水。

操作步驟：

一、羥脯氨酸提取：

1、組織：稱取約0.2g樣品于玻璃管，將組織盡量剪碎以便消化，蓋子稍松不密閉。加入2mL的提取液，煮沸或110℃烘箱2至6小時消化至沒有可見大的團塊，16000rpm，25℃，離心20min（若離心后仍有雜質(zhì)，可通過過濾去除），用10mol/LNaOH（約1mL）調(diào)節(jié)pH值至6～8范圍內(nèi)。蒸餾水定容至4mL，取上清待測。（過程中可能有黑色物質(zhì)生成，若長時間不能消化，可能為碳化的物質(zhì)）

2、細胞：取500萬個細胞，加入1mL的提取液，煮沸或110℃烘箱2至6小時消化至透明狀，16000rpm，25℃，離心20min，用10mol/LNaOH（約0.5mL）調(diào)節(jié)pH值至6～8范圍內(nèi)。蒸餾水定容至2mL，取上清待測。

二、測定步驟：

1、將標準品稀釋為30、15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.234µg/mL的標準溶液。

2、分光光度計預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至560nm，蒸餾水調(diào)零。

3、按下表進行操作： 

三、羥脯氨酸含量計算公式

1、標準曲線的繪制：

以標準溶液的濃度為x軸，?A標準（?A =A標準管-A空白管）為y軸，繪制標準曲線，得到方程y=kx+b。將?A測定（?A =A測定管-A空白管）帶入方程得到x。

2、羥脯氨酸含量的測定：

（1）按樣本鮮重計算：

組織羥脯氨酸含量（µg/g鮮重）= x×V樣品÷（W×V樣品÷V組提）=4x÷W

（2）按樣本蛋白濃度計算：

組織羥脯氨酸含量（µg/mg prot）= x×V樣品÷（Cpr×V樣品）=x÷Cpr

（3）按細菌或細胞數(shù)量計算：

細胞羥脯氨酸含量（µg/10⁴cell）= x×V樣品÷（細胞數(shù)量×V樣品÷V胞提）=2x÷細胞數(shù)量

V樣品：加入的樣品體積，0.06mL；V組提：組織提取液體積，4mL；V胞提：細胞提取液體積，2mL；W：樣本鮮重，g；細胞數(shù)量：以10⁴為單位，萬個；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。

注意事項：

1、OD值大于1.0，樣品適當稀釋再測定，注意計算公式里乘以稀釋倍數(shù)。

2、試劑有一定的毒性，請操作時做好防護措施，防止吸入或與皮膚接觸。

3、按樣本蛋白濃度計算時，需單獨提取樣本中的蛋白質(zhì)并測定。