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丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒（微量法）

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定。

產(chǎn)品貨號：BA1066

產(chǎn)品規(guī)格：100管/96樣

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體30mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×2瓶，4℃保存；

MDA檢測工作液的配制：用時在每瓶試劑二中加入15mL試劑一，溶解混勻，4℃保存待用。

試劑三：液體10mL×1瓶，4℃保存；

注意事項(xiàng)：MDA檢測工作液較難溶解，可以70℃加熱，并劇烈振蕩以促進(jìn)溶解?；蛘咄ㄟ^超聲處理以促進(jìn)溶解。

產(chǎn)品說明：

氧自由基作用于脂質(zhì)的不飽和脂肪酸，生成過氧化脂質(zhì)；后者逐漸分解為一系列復(fù)雜的化合物，其中包括丙二醛 MDA。通過檢測 MDA 的水平即可檢測脂質(zhì)氧化的水平。

丙er醛（MDA）在酸性和高溫條件下，可以與硫代ba比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)縮合，生成棕紅色的san甲川（3,5,5-san甲基惡唑-2，4-er酮），其最大吸收波長在532nm。進(jìn)行比色后可估測樣品中過氧化脂質(zhì)的含量。但是測定植物組織中MDA時受多種物質(zhì)的干擾，其中最主要的是可溶性糖，糖與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長在450nm，但532nm處也有吸收。所以同時測定600nm、532nm、450nm下的吸光度，利用532nm與450nm、600nm下的吸光度的差值計(jì)算MDA的含量。

由于植物中受蔗糖干擾較大，動物中受葡萄糖干擾較大，所以本試劑盒有針對蔗糖和葡萄糖的兩個公式。若所測樣品為油脂類物質(zhì)，則兩個公式均可。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、MDA提取：

1、細(xì)菌或細(xì)胞樣品的制備：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每400萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率20％，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2. 組織樣品的制備：稱取約0.1g組織，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

二、測定操作：

1、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，蒸餾水調(diào)零。

2、按下表步驟加樣：

混合液在100℃水浴中保溫30min后（蓋緊，防止水分散失），置于冰浴中冷卻，10000g，常溫，離心10min。吸取200uL上清液于微量玻璃比色皿或96孔板中，測定各樣品在450nm、532nm和600nm處的吸光度。

三、MDA含量計(jì)算：

a. 按96孔板計(jì)算

1、細(xì)菌、細(xì)胞或動物組織中MDA含量計(jì)算

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

MDA含量（nmol/ mg prot）=（12.9×（A₅₃₂-A₆₀₀）-2.58×A₄₅₀）×V總÷（Cpr×V樣本）

=5×（12.9×（A₅₃₂-A₆₀₀）-2.58×A₄₅₀）÷Cpr

（2）按照樣品質(zhì)量計(jì)算

MDA 含量（nmol/ g 鮮重）=（12.9×（A₅₃₂-A₆₀₀）-2.58×A₄₅₀）×V總÷（W×V樣本÷V提?。?/span>

=5×（12.9×（A₅₃₂ -A₆₀₀）-2.58×A₄₅₀）÷W

(3) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

MDA 含量（nmol/10⁴ cell）=（12.9×（A₅₃₂-A₆₀₀）-2.58×A₄₅₀）×V總÷（400÷V提取×V樣本）

=0.125×（12.9×（A₅₃₂-A₆₀₀）-2.58×A₄₅₀）

V總：反應(yīng)體系總體積，0.5mL；V樣品：加入樣品體積，0.1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。 W：樣品質(zhì)量，g；400：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，400萬；V提?。禾崛∫后w積，1mL。

2、植物組織中MDA含量計(jì)算

（1）按照樣品質(zhì)量計(jì)算

MDA含量（nmol/ g鮮重）=（12.9×（A₅₃₂-A₆₀₀）-1.12×A₄₅₀）×V總÷（W×V樣本÷V提?。?/span>

=5×（12.9×（A₅₃₂-A₆₀₀）-1.12×A₄₅₀）÷W

（2）按照蛋白濃度計(jì)算

MDA含量（nmol/ mg prot）=（12.9×（A₅₃₂-A₆₀₀）-1.12×A₄₅₀）×V總÷（Cpr×V樣本）

=5×（12.9×（A₅₃₂-A₆₀₀）-1.12×A₄₅₀）÷Cpr

V總：反應(yīng)體系總體積，0.5mL；V樣品：加入樣品體積，0.1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。W：樣品質(zhì)量，g；V提?。禾崛∫后w積，1mL。

b. 按微量比色皿計(jì)算

1、細(xì)菌、細(xì)胞或動物組織中MDA含量計(jì)算

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

MDA含量（nmol/ mg prot）=（6.45 ×（A₅₃₂-A₆₀₀）-1.29×A₄₅₀）×V總÷（Cpr×V樣本）

=5×（6.45 ×（A₅₃₂-A₆₀₀）-1.29×A₄₅₀）÷Cpr

（2）按照樣品質(zhì)量計(jì)算

MDA含量（nmol/ g鮮重）=（6.45 ×（A₅₃₂-A₆₀₀）-1.29×A₄₅₀）×V總÷（W×V樣本÷V提取）

=5×（6.45 ×（A₅₃₂-A₆₀₀）-1.29×A₄₅₀）÷W

(3) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

MDA 含量（nmol/10⁴ cell）=（6.45 ×（A₅₃₂-A₆₀₀）-1.29×A₄₅₀）×V 總÷（400×V樣本÷V提?。?/span>

=0.0125×（6.45 ×（A₅₃₂-A₆₀₀）-1.29×A₄₅₀）

V總：反應(yīng)體系總體積，0.5mL；V樣品：加入樣品體積，0.1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。W：樣品質(zhì)量，g；400：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，400萬；V提?。禾崛∫后w積，1mL。

2、植物組織中MDA含量計(jì)算

（1）按照樣品質(zhì)量計(jì)算

MDA含量（nmol/ g鮮重）=（6.45 ×（A₅₃₂-A₆₀₀）-0.56×A₄₅₀）×V總÷（W×V樣本÷V提取）

=5×（6.45 ×（A₅₃₂-A₆₀₀）-0.56×A₄₅₀）÷W

（2）按照蛋白濃度計(jì)算

MDA含量（nmol/ mg prot）=（6.45 ×（A₅₃₂-A₆₀₀）-0.56×A₄₅₀）×V總÷（Cpr×V樣本）

=5×（6.45 ×（A₅₃₂-A₆₀₀）-0.56×A₄₅₀）÷Cpr

V總：反應(yīng)體系總體積，0.5mL；V樣品：加入樣品體積，0.1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。W：樣品質(zhì)量，g；V提取：提取液體積，1mL。