5’-核苷酸酶活性檢測(cè)試劑盒可見分光光度法 返回列表頁(yè)

5’-核苷酸酶活性檢測(cè)試劑盒（可見分光光度法）

產(chǎn)品貨號(hào): BA1641

產(chǎn)品規(guī)格: 50T

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

5'-核苷酸酶(5'-NT)是一種對(duì)底物特異性不高的水解酶，可作用于多種核苷酸。廣泛存在于各種植物、動(dòng)物組織、 血清血漿中。5'-NT是一種特殊的磷酸酯水解酶，它只作用于核苷-5'-磷酸如AMP(腺苷-5'-磷酸或腺苷酸)生成無機(jī) 磷酸和核苷。通過定磷顯色法測(cè)定所生成的無機(jī)磷含量，可以計(jì)算出5'-NT的活性高低。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者 增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

產(chǎn)品組成：

溶液的配制：

1.        試劑五：臨用前加入12 mL蒸餾水，充分溶解，用不完的試劑4℃保存兩周。

2.        試劑六：臨用前加入12 mL蒸餾水，充分溶解，用不完的試劑4℃保存兩周。

3.        工作液配制：臨用前取1支試劑一中加入到1瓶試劑二中充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存一周， 現(xiàn)用現(xiàn)配。

4.        定磷試劑的配制：按H2O：試劑五：試劑六：試劑七=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。 若無色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染（請(qǐng)根據(jù)需要，用多少配多少）。

5.        標(biāo)準(zhǔn)品：8mg磷標(biāo)準(zhǔn)品。臨用前加入4.6mL試劑四溶解配制成10μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，溶解后4℃保存兩周。

需自備的儀器和用品：

天平、可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、低溫離心機(jī)、恒溫水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、1mL玻璃比色皿、可調(diào)式移 液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟（僅供參考）：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1.        組織：按照質(zhì)量（g）﹕提取液體積(mL)為1﹕5-10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液），冰上勻漿后于4℃，15000g離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

2.        細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）﹕蒸餾水體積（mL）為500-1000﹕1的比例（建議500萬個(gè)細(xì)胞加入1mL提取液）， 冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300W，超聲3s，間隔7s，總時(shí)間3min）；然后4℃，15000g離心10 min，取上清置于冰上待測(cè)。

3.        血清：直接檢測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1.        分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至660nm，蒸餾水調(diào)零。

2.        將標(biāo)準(zhǔn)品用試劑四稀釋至0.48、0.24、0.12、0.06、0.03、0.015μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液。

3.        操作表（在1.5 mL EP管中操作）

（1）酶促反應(yīng)

（2）顯色反應(yīng)

三、5'-NT活性計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制： 以各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為x軸，其對(duì)應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y= kx+b，將ΔA帶入方程得到x（μmol/mL）。

5'-NT 活性的計(jì)算

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每 mg 組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1nmol無機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

5'-NT酶活（U/mg prot）=x×V反總÷(V樣×Cpr)÷T×103=333.3×x÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1 nmol無機(jī)磷定義為一個(gè)酶活單位。

5'-NT酶活（U/g質(zhì)量）=x×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T×103=333.3×x÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)計(jì)算：

酶活單位定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1nmol無機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

5'-NT酶活（U/10⁴ cell）=x×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T×103=333.3×x÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算：

酶活單位定義：每毫升液體在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1 nmol無機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

5'-NT酶活（U/mL）=x×V反總÷V樣÷T×103=333.3×x

V樣：酶促反應(yīng)中加入樣本體積，0.1mL；V反總：酶促反應(yīng)總體積，1mL；V樣總：加入提取液的體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；細(xì)胞數(shù)量：以萬計(jì)；T：酶促反應(yīng)時(shí)間，30 min；10³：?jiǎn)挝粨Q算，1μmol=10³nmol。

注意事項(xiàng):

1.        ΔA測(cè)定大于1或者A測(cè)定管大于1時(shí)，建議將樣本用試劑四稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1.        取0.1g小鼠肝，進(jìn)行樣本處理，取上清后按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定管=A測(cè)定-A對(duì)照=0.723- 0.534=0.189，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=2.3928x+0.0165，計(jì)算x=0.0721，按照樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

5'-NT酶活（U/g質(zhì)量）=333.3×x÷W=333.3×0.0721÷0.1=240.31 U/g 質(zhì)量。

2.        取0.1g稗草，進(jìn)行樣本處理，取上清后按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定管=A測(cè)定-A對(duì)照=0.367-0.281=0.086， 帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=2.3928x+0.0165，計(jì)算x=0.0290，按照樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

5'-NT酶活（U/g質(zhì)量）=333.3×x÷W=333.3×0.0290÷0.1=96.657 U/g質(zhì)量。