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一步法細(xì)菌活性蛋白提取試劑盒

產(chǎn)品貨號：26124

產(chǎn)品規(guī)格：20T

產(chǎn)品簡介：

一步法細(xì)菌活性蛋白提取試劑盒適用于從細(xì)菌裂解液中提取可溶性蛋白和包涵體蛋白回收。該試劑盒采用一種溫和的、可通過透析去除的非離子型去污劑裂解細(xì)菌細(xì)胞，溶解蛋白，不需要超聲等機(jī)械細(xì)胞破碎方法，且提取效率要高于機(jī)械細(xì)胞破碎方法。提取的可溶性蛋白絕大多數(shù)能保持其活性。該試劑盒提供的Lysozyme和DNase I可以提高分子量大于60kDa可溶性蛋白和蛋白包涵體沉淀的洗滌回收效率，提取的可溶性蛋白可以直接用于電泳、免疫共沉淀、蛋白質(zhì)鉸鏈、標(biāo)記、Pull Down、EMSA、酶免分析（Western Blot、ELISA、RIA）等實(shí)驗(yàn)?？梢允褂?/span>20次。

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1. 可以在20min內(nèi)完成對細(xì)菌可溶性蛋白的提取。

2. 該試劑可以同時實(shí)現(xiàn)可溶性蛋白提取和蛋白包涵體洗滌、沉淀和回收。

3. 提取的可溶性蛋白可以直接用于電泳、免疫共沉淀、蛋白質(zhì)鉸鏈、標(biāo)記、Pull Down、EMSA等實(shí)驗(yàn)。

4. 提取的蛋白質(zhì)可以透析去除離子和去污試劑，或?qū)⒕彌_液替換為所需要的合適緩沖液。

5. 可以按照需要按比例擴(kuò)大提取的菌體的量，比較合適于重組蛋白的快速篩選。

操作步驟：

1. 5000×g離心10分鐘收集細(xì)菌細(xì)胞沉淀。

注意：如果需要，可以在每毫升的提取試劑中加入2μL of Lysozyme和2μL of DNase I。  

2. 按照每100mg的濕重菌體中加入0.5mL的提取試劑（使用前向每1mL提取試劑中加入1μL DTT和10μL PMSF），用槍頭反復(fù)吹打使之形成均勻的懸液。

3. 將其放置在脫色搖床上280rpm室溫振蕩20分鐘左右。

注意：實(shí)際需要時間可以根據(jù)細(xì)菌的不同品種做調(diào)整，如果提取試劑中已經(jīng)加入了Lysozyme和DNase I，請?jiān)?/span>37°放置以促進(jìn)對細(xì)菌細(xì)胞壁和核酸的消化。

4. 15000×g離心5分鐘，收集上清作為細(xì)菌可溶性部分，不溶解的細(xì)胞碎片和可能含有的包涵體沉淀留作分析或回收用。

注意，重復(fù)步驟2~4一次，將兩次的上清合并，可以提高可溶性蛋白的提取效率，如果樣品在細(xì)胞裂解后變得粘稠，請向抽提試劑中適量增加DNase I以消化核酸。

5. 將沉淀用0.25mL的提取試劑渦旋振蕩懸浮, 取少量（10-20μL ）和上清一起做SDS-PAGE電泳以確認(rèn)表達(dá)蛋白是否溶解或以包涵體形式存在或者兩者兼而有之。

如果表達(dá)的蛋白是包涵體沉淀，可以繼續(xù)按照以下步驟操作。

6. 在沉淀懸浮液中向每毫升提取試劑中加入4μL of Lysozyme和2μL of DNase I，渦旋振蕩以充分懸浮菌體，在37°下放置30~60分鐘左右。

7. 加入1mL用雙蒸水稀釋10倍的提取試劑，渦旋振蕩1分鐘。

8. 15000×g離心5分鐘，收集包涵體沉淀。

9. 重復(fù)步驟7~8兩次 可以進(jìn)一步洗滌去除包涵體和溶液中的雜質(zhì)。

10. 將包涵體沉淀重懸于300μL超純水或緩沖液中，吸取10~20μL 通過SDS- PAGE進(jìn)行純度檢測或進(jìn)一步純化

注意事項(xiàng)：

1. 本產(chǎn)品可以從剛收集的細(xì)菌或凍存的細(xì)菌中提取蛋白，但從凍存的細(xì)菌提取效率會相對更高，本試劑從蛋白缺陷的BL21等幾種常用的細(xì)菌中提取可溶性蛋白的效率較高，如果對于某些細(xì)菌的裂解效率不高,可以在提取前反復(fù)凍溶1~2次以提高提取效率。

2. 本產(chǎn)品只提供PMSF絲氨酸蛋白酶抑制劑，如果需要請購買我司生產(chǎn)的蛋白酶抑制劑混合物，EDTA也可以加入到提取試劑中，終濃度為5mM，但是它會抑制DNase I的消化作用，同時也會破壞NI-NTA樹脂，所以加入時要根據(jù)下游實(shí)驗(yàn)的要求作出選擇。

3. 加入Lysozyme和DNase I到提取試劑，可以提高蛋白質(zhì)的提取效率，但是對于表達(dá)的蛋白分子量小于60k,而且全是可以溶解的，可以不加Lysozyme和DNase I。對于加入Lysozyme和DNase I會影響下游操作時，也盡量不要加。

4. 對于形成的包涵體蛋白，可以使用我司生產(chǎn)的包涵體溶解液溶解及后續(xù)純化。

5. 如需要，請?jiān)趯?shí)驗(yàn)前在抽提試劑中加入1倍濃度的我司生產(chǎn)的磷酸酶抑制試，再進(jìn)行細(xì)菌活性蛋白質(zhì)的提取。

6. 提取試劑在低溫下容易起霧，請恢復(fù)至室溫后再使用。

7. 可以使用Sephadex重力型脫鹽柱脫鹽或?qū)⒕彌_液替換為所需要的目的蛋白質(zhì)合適緩沖液。

8. 對于提取的蛋白質(zhì)，可以采用我公司生產(chǎn)的改良型BCA法蛋白濃度定量試劑盒或非干擾型蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒或改良型Lowry法蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒對提取樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。

9. 如果用于蛋白質(zhì)質(zhì)譜研究，請用我司生產(chǎn)的銅染或鋅染或質(zhì)譜用快速銀染試劑盒對膠上的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色，這些染色方法對蛋白質(zhì)沒有修飾作用，所以對質(zhì)譜圖沒有影響。對于一般的染色，可以采用無毒型考馬氏亮藍(lán)染色液或高靈敏考馬氏亮藍(lán)染色液進(jìn)行染色。

10. 產(chǎn)品中的保存條件及有效期均以未開封情況下計算，為了防止產(chǎn)品與空氣接觸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)影響產(chǎn)品性能，將未使用完畢的組分按存儲要求保存同時建議開封后的組分盡快使用完畢。

11. 使用后，請旋緊瓶蓋防止溶液揮發(fā)和與空氣中的物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。

12. 本試劑盒只能夠用于體外實(shí)驗(yàn)，不能夠用于臨床、治療和動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等，由此產(chǎn)生的后果，概不承擔(dān)責(zé)任。

有效期：24個月有效。