恒光講堂｜NaGdF4納米探針：用于靶向細(xì)菌的NIR-II光聲成像

本文要點(diǎn)：細(xì)菌感染嚴(yán)重危害人類生命與健康，在感染早期及時(shí)診斷并治療可以減輕患者痛苦甚至挽救生命，現(xiàn)有的技術(shù)手段可以檢測區(qū)分細(xì)菌種類，但耗時(shí)過長，浪費(fèi)了寶貴的治療時(shí)間。因此作者合成了一種適用于診斷體內(nèi)細(xì)菌感染的熒光探針DCNPs。該探針在近紅外二區(qū)窗口下，擁有高熒光強(qiáng)度和深穿透性。同時(shí)，作者將該探針與萬古霉素共價(jià)結(jié)合后（DCNPs-Van），探針能夠與革蘭氏陽性細(xì)菌特異性結(jié)合。在體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證中，萬古霉素修飾后的探針可以對革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌加以區(qū)分，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)細(xì)菌感染的早期快速診斷。

納米探針DCNPs-Van合成示意圖及體內(nèi)細(xì)菌感染的光聲成像示意圖（圖 1）。

圖 1：(a) 探針DCNPs-Van的合成路線。(b)基于DCNPs-Van的體內(nèi)革蘭氏陽性細(xì)菌靶向成像示意圖。

首先，DCNPs的親水側(cè)暴露出的羧基（-COOH）可以和萬古霉素的氨基（-NH2）共價(jià)結(jié)合，變成可以靶向細(xì)菌的納米探針（DCNPs-Van）。電鏡下觀察兩種納米粒子，OA-DCNPs和DCNPs-Van均呈單分散，且DCNPs-Van的形態(tài)和粒徑與OA-DCNPs相比差異較小，表明其結(jié)晶性良好（圖 2）。

圖2：(a) OA-DCNPs和(c) DCNPs-Van的TEM圖像。(b) OA-DCNPs和(d) DCNPs-Van粒徑分布圖像。

對納米探針測定其發(fā)射曲線，發(fā)現(xiàn)NaGdF4:5 %Nd NPs在1060 nm 和1330 nm處均有發(fā)射帶（圖 3a）。同時(shí)因?yàn)闇p少了納米粒子表面的淬滅劑，NaGdF4:Nd@NaGdF4核殼型NPs下轉(zhuǎn)換發(fā)射強(qiáng)度強(qiáng)于NaGdF4:5 %Nd NPs。接下來，作者探究了Nd 3+離子濃度對NaGdF4:Nd@NaGdF4核殼型NPs下轉(zhuǎn)換熒光強(qiáng)度與晶體結(jié)構(gòu)的影響。當(dāng)增加Nd 3+離子到10 %時(shí)，依然沒有改變其發(fā)光強(qiáng)度（圖 3b）。此外，NaGdF4:5 %Nd NPs也表現(xiàn)出了很高的量子產(chǎn)率，接近28.5 %（圖 3c），這一數(shù)值超過了大部分鑭系的商用染料。

圖3: (a) NaGdF4:5 % ND和NaGdF4:5 %Nd@NaGdF4NPs的發(fā)射光譜。(b) NaGdF4:xNd@NaGdF4 NPs (x = 1,3,5,8，或10%)發(fā)射光譜。(c)在808 nm激光激發(fā)下，OA-DCNPs在環(huán)己烷中和DCNPs-Van在水中的發(fā)射光譜。(d) Van、PAA-DCNPs和DCNPs-Van的紫外-可見吸收光譜。

接下來，作者便將DCNPs-Van與革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌共孵育，在電鏡下可以觀測，探針逐漸與細(xì)菌表面結(jié)合（圖 4a-d）。為了驗(yàn)證探針的特異性，作者選擇革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌作為對照，分別將不同濃度的大腸桿菌與金黃色葡萄球菌共孵育，對沉淀和上清液進(jìn)行NIR-II光聲成像（圖4e-j）。隨著金黃色葡萄球菌濃度增高，沉淀的熒光信號加強(qiáng)，而上清液中熒光信號逐漸減弱。而在大腸桿菌光聲成像中，沉淀的熒光強(qiáng)度和上清液的熒光強(qiáng)度都不會(huì)隨著細(xì)菌濃度的改變而改變。證明DCNPs-Van可以與革蘭氏陽性細(xì)菌特異性結(jié)合。

圖4：(a, b)金黃色葡萄球菌和(c, d) DCNPs-Van標(biāo)記后金黃色葡萄球菌的SEM圖像;(e)金黃色葡萄球菌懸液和(h)大腸桿菌懸液在808 nm激發(fā)(300 mW/cm2)下的NIR-II光聲圖像;(f)金黃色葡萄球菌懸浮液、(g)金黃色葡萄球菌上清液、(i)大腸桿菌懸浮液和(j)不同細(xì)菌濃度下的大腸桿菌上清液熒光強(qiáng)度變化曲線圖。

接下來，作者又探究了DCNPs-Van在體內(nèi)NIR-II光聲成像的效果。首先作者將PAA-DCNPs分別注射到感染金黃色葡萄球菌與大腸桿菌的小鼠體內(nèi)，在感染部位均未觀察到熒光信號（圖5 a，b）。然后，作者又將DCNPs-Van注射到兩種小鼠體內(nèi)，在金黃色葡萄球菌感染小鼠體內(nèi)，注射探針6 h后，感染部位出現(xiàn)明顯的熒光信號，直至24 h。而大腸桿菌感染小鼠未見熒光信號（圖5 c-e）。

圖5：在808 nm激光激發(fā)下，不同模型小鼠的NIR-II光聲圖像（300 mW / cm2）。（a）PAA-DCNPs注射到金黃色葡萄球菌感染小鼠體內(nèi)。（b）PAA-DCNPs注射到大腸桿菌感染小鼠體內(nèi)。（c）DCNPs-Van注射到金黃色葡萄球菌感染小鼠體內(nèi)。（d）DCNPs-Van注射到大腸桿菌感染小鼠體內(nèi)。

作者又探究了探針在體內(nèi)的生物相容性。通過MTT測試，當(dāng)DCNPs-Van濃度達(dá)到1000μg/ mL時(shí)，共孵育的NIH / 3 T3細(xì)胞（鼠胚胎細(xì)胞）活性在80 %，表明其具有良好的體外生物相容性（圖6 a）。將DCNPs-Van注射到健康小鼠體內(nèi)，熒光信號主要集中在肝臟中，且在注射后第九天，熒光信號消失，表明探針可以經(jīng)過肝臟代謝（圖6 b）。對小鼠進(jìn)行組織切片觀察，各器官與對照組小鼠相比無異常變化（圖6 c）。

圖6:（a）用不同濃度DCNPs-Van處理小鼠NIH/3T3細(xì)胞得到的細(xì)胞相對活性結(jié)果。（b）在注射探針后第3天和第9天，小鼠器官的NIR-II光聲圖像。（c）在注射探針后第3天和第9天，小鼠器官的H＆E染色圖像。

結(jié)論：作者開發(fā)了一個(gè)具有高量子產(chǎn)率的NIR-II納米探針，同時(shí)將其與萬古霉素共價(jià)結(jié)合。新的探針保留了原有探針的穩(wěn)定性，安全性與熒光特征，并可以在體內(nèi)外和革蘭氏陽性細(xì)菌特異性結(jié)合。這可以用于開發(fā)體內(nèi)細(xì)菌感染的早期診斷試劑，為實(shí)驗(yàn)室和臨床診斷細(xì)菌感染提供便捷。

參考文獻(xiàn)

Leilei Sun, Sisi Shi, Hongchao Geng, YaoHuang, Yan Qiao, Jie Song, Lan Yang, Craig A. Grimes, Xinxin Feng, and Qingyun Cai.NaGdF4:Nd@NaGdF4 Core-ShellDown-Conversion Nanoparticles as NIR-II Fluorescent Probes for Targeted Imagingof Bacteria.ACS Applied Nano Materials 2021 4 (10), 11231-11238.

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