聚合物納米顆粒在活體小鼠頸動脈斑塊負(fù)荷成像中的NIR-II應(yīng)用

本文要點(diǎn)：大多數(shù)動脈粥樣硬化血栓事件（例如，腦或心肌梗死）通常是由頸動脈斑塊破裂或侵蝕引起的，因此迫切需要評估斑塊的脆弱性并預(yù)測不良腦血管事件。然而，由于沒有足夠的空間分辨率來基于大多數(shù)報(bào)道的熒光探針對頸動脈進(jìn)行成像，因此監(jiān)測細(xì)長頸動脈中從穩(wěn)定斑塊到危及生命的高危斑塊的演變是一個巨大的挑戰(zhàn)。

研究內(nèi)容：本文報(bào)道的NIR-II納米探針是受體-供體-受體-供體-受體（A-D-A′-D-A）分子和給電子單元（D′）共聚，具有高量子產(chǎn)率和良好的穩(wěn)定性，能夠以足夠的空間分辨率對細(xì)長的頸動脈血管進(jìn)行成像。NIR-II納米探針還可以有效靶向斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞，同時區(qū)分活體小鼠頸動脈粥樣硬化中的易損斑塊。NIR-II納米探針可以動態(tài)監(jiān)測頸動脈斑塊中的新鮮出血點(diǎn)。此外，磁共振成像與NIR-II熒光成像相結(jié)合，通過將超小的超順磁性氧化鐵加入NIR-II納米探針中，提高細(xì)微的結(jié)構(gòu)的對比度。因此，這種混合NIR-II/磁共振成像多模式納米探針為評估頸動脈斑塊負(fù)荷、選擇高危斑塊和對斑塊內(nèi)出血進(jìn)行成像提供了一種有效的工具，有望降低腦/心肌梗死相關(guān)的發(fā)病率和死亡率。（Figure.1）

Figure.1

Figure.2

半導(dǎo)體聚合物的合成路線如Fig.2A所示，通過A-D-A′-D-A分子與各種給體單元(即噻吩、苯并二噻吩和二硫苯并噻二唑)共聚，分別合成了3種半導(dǎo)體聚合物，即NIR-1、NIR-2和NIR-3。Fig.2C展示了NIR-1的密度泛函理論分子軌道圖，由于多重ICT，HOMO-LUMO發(fā)生分離，使吸收波長延長。作者還研究了這些半導(dǎo)體聚合物在甲苯中的吸收光譜與發(fā)射光譜（Fig.2D、E），其中NIR-1顯示出吸收峰與熒光強(qiáng)度。

為了提高生物安全性和血液循環(huán)時間，采用納米沉淀法（Fig.2B），通過DSPE-PEG2000將半導(dǎo)體聚合物轉(zhuǎn)化為半導(dǎo)體聚合物納米顆粒(SPNs)。透射電子顯微鏡(TEM)證實(shí)SPNs(NIR-1)大致呈球形(Fig.2H),動態(tài)光散射尺寸為43-50nm。如Fig.2 F、G所示，SPNs(NIR-1)、SPNs(NIR-2)和SPNs(NIR-3)的吸收峰分別為780、830和800 nm，并且均表現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光發(fā)射，其中SPNs(NIR-1)的熒光中心峰。為了研究SPNs的NIR-II熒光性能，使用ICG作為參考，在808 nm激發(fā)下， SPNs(NIR-1)表現(xiàn)出熒光強(qiáng)度（Fig.2 I、J）。此外，SPNs(NIR-1) 的熒光強(qiáng)度隨著濃度升高而升高（Fig.2K）。在激光連續(xù)照射后，這些SPNs的熒光略有衰減，ICG熒光衰減（Fig.2L）。考慮到SPNs(NIR-1)擁有熒光信號和熒光穩(wěn)定性，后期實(shí)驗(yàn)選擇了SPNs(NIR-1)。

NIR-II /MRI混合納米粒子的構(gòu)建。首先，在有機(jī)溶劑中采用熱解的方法合成了SPIO納米粒子，然后采用一步式納米沉淀法制備了混合半導(dǎo)體聚合物納米顆粒@超順磁性氧化鐵(SPNs(NIR-1)@ SPIO) （Fig.2B）。使用核磁共振分析儀測量溶液中SPNs(NIR-1)@ SPIO的縱向(r1)和橫向(r2)弛豫，r2/r1比為38.8（Fig.2N）。SPNs(NIR-1)@ SPIO的MR圖像顯示，T2加權(quán)MRI信號強(qiáng)度隨著濃度的增加逐漸降低（Fig.2O），而NIR-II圖像顯示，NIR-II熒光信號隨著濃度的增加而增加（Fig.2P）。這些結(jié)果表明了SPNs(NIR-1)@ SPIO在雙模態(tài)MR和NIR-II熒光成像中的潛力。

Figure.3

接下來作者進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，制備了左側(cè)頸動脈粥樣硬化斑塊小鼠模型（AS小鼠）（Fig.3A），HE染色圖像（Fig.3B）顯示，小鼠的左側(cè)頸動脈（LCA）中動脈粥樣硬化斑塊局部形成，而右側(cè)頸動脈(RCA)保持通暢且無斑塊。注射SPNs(NIR-1)后進(jìn)行NIR-II熒光成像，LCA的熒光強(qiáng)度高于RCA的熒光強(qiáng)度（Fig.3C），沿其中的紅線RCA和LCA中的熒光強(qiáng)度分布如Fig.3D所示。為了探索頸動脈粥樣硬化斑塊的MRI成像，對AS小鼠靜脈注射SPNs(NIR-1)@SPIO，Fig.3E、F是2個隨機(jī)的非連續(xù)切片，比較注射前(綠色圓圈)和注射后(橙色圓圈)圖像，發(fā)現(xiàn)注射后斑塊中的脂質(zhì)池(白色箭頭)變得略暗?？紤]到巨噬細(xì)胞是易損斑塊的靶點(diǎn)，作者探索了巨噬細(xì)胞對SPNs(NIR-1)的細(xì)胞攝取。使用Cy5.5標(biāo)記NIR-1制備成得到Cy5.5-SPNs（NIR-1），與巨噬細(xì)胞Raw264.7共孵育，發(fā)現(xiàn)隨著時間延長，細(xì)胞的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)（Fig.3H、I）。此外，還對比了血管內(nèi)皮細(xì)胞（C166），結(jié)果表明Cy5.5-SPNs（NIR-1）可以被巨噬細(xì)胞而不是上皮細(xì)胞有效地?cái)z?。?span style="box-sizing: border-box">Fig.3J、K）。

Figure.4

作者還進(jìn)行了NIR-II成像鑒別體內(nèi)不穩(wěn)定斑塊的實(shí)驗(yàn)。使用健康小鼠作為對照，分別對動脈粥樣硬化小鼠(AS小鼠)和動脈粥樣硬化合并急性間質(zhì)性肺炎小鼠(AS小鼠+AIP)的頸動脈斑塊進(jìn)行了NIR-II熒光成像(Fig.4A)。分析病理特征(Fig.4B)，健康小鼠的無斑塊血管、AS小鼠的動脈粥樣硬化血管變窄和斑塊(綠色虛線)以及AS小鼠+ AIP的斑塊(綠色虛線)中有一個大的軟脂質(zhì)池(黑色虛線)。肺部HE染色圖像(Fig.4B)、體溫變化曲線(Fig.4C)、中性粒細(xì)胞和外周血白細(xì)胞（WBCs）計(jì)數(shù)圖(Fig.4D)均表明LPS處理的小鼠的具有肺部炎癥。

為了測試SPNs(NIR-1)對頸動脈不穩(wěn)定斑塊進(jìn)行NIR-II熒光成像的能力，向健康小鼠、AS小鼠和AS+AIP小鼠靜脈注射SPNs(NIR-1)，由NIR-II熒光圖像可知，隨著時間增加，AS小鼠和AS+AIP小鼠的LCA熒光信號逐漸增強(qiáng)(Fig.4E)，從定量結(jié)果來看，在注射后120分鐘，AS小鼠+ AIP小鼠的LCA熒光信號分別是AS小鼠或健康小鼠的3倍或15倍(Fig.4G)。 

作者還研究了這些小鼠的血脂水平和炎癥指標(biāo)，與健康小鼠相比，AS小鼠和AS小鼠+AIP表現(xiàn)出TG和總膽固醇（TC）水平增加，AS小鼠+AIP顯示出比AS小鼠或健康小鼠更低的HDL-C水平，表明膽固醇去除能力降低，這可能導(dǎo)致動脈粥樣硬化病變(Fig.4I)。通過免疫熒光染色檢測了巨噬細(xì)胞在頸動脈中的浸潤，發(fā)現(xiàn)AS小鼠和AS小鼠+AIP中浸潤的巨噬細(xì)胞更多(Fig.4J、K)。

Figure.5

斑塊內(nèi)出血（IPH）（尤其是頸動脈），被認(rèn)為是高危斑塊的重要信號，可能導(dǎo)致缺血性中風(fēng)和血栓性并發(fā)癥。為了制備IPH模型，向LCA中的動脈粥樣硬化斑塊微注射小劑量或大劑量的新鮮血液，同時以AS小鼠作為對照組(Fig.5A)。左頸動脈的代表性HE染色圖像證實(shí)了新鮮血液局部注入后斑塊內(nèi)IPH的存在（Fig.5B）。Fig.5C展示了在IPH后1小時向小鼠靜脈注射SPNs(NIR-1)的熒光圖像，Fig.5E、F顯示了不同組在不同時間點(diǎn)的LCA和RCA的熒光強(qiáng)度。從離體圖像來看，AS小鼠+大IPH的LCA熒光強(qiáng)度分別是AS小鼠+小IPH和AS小鼠的1.7倍和4.17倍(Fig.5D、G)。這些結(jié)果證明了SPNs(NIR-1)在小鼠中進(jìn)行IPH NIR-II成像的巨大潛力，并且有利于對易損斑塊進(jìn)行早期成像并給出預(yù)警信號。

總結(jié)：作者篩選了一系列具有強(qiáng)吸收/發(fā)射的NIR-II熒光聚合物，選擇了一種具有良好的NIR-II熒光QY的熒光聚合物，并將其制備成納米探針。SPNs(NIR-1)顯示了頸動脈血管造影術(shù)的NIR-II熒光成像在空間分辨率方面的優(yōu)勢。此外，作者采用SPNs(NIR-1)通過頸動脈中熒光信號的動態(tài)變化來區(qū)分易損斑塊與穩(wěn)定斑塊以及IPH。動脈內(nèi)熒光強(qiáng)度的局部變化與斑塊的病理特征有很好的相關(guān)性。此外，作者通過在NIR-II納米探針中加入超小SPIO效應(yīng)制備了混合NIR-II/MRI多模式探針，為頸動脈斑塊的空間成像提供了有效工具。因此，這種新型的血管成像平臺可用于早期監(jiān)測斑塊的病理變化，為監(jiān)測和早期預(yù)警頸動脈高危斑塊提供了有力的成像工具。

參考文獻(xiàn)

Xu, L.; Li, Z.; Ma, Y.; Lei, L.; Yue, R.; Cao, H.; Huan, S.; Sun, W.; Song, G., Imaging Carotid Plaque Burden in Living Mice via Hybrid Semiconducting Polymer Nanoparticles-Based Near-Infrared-II Fluorescence and Magnetic Resonance Imaging. Research 2023, 6.

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近紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

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