免疫檢測的基礎知識

ELISA是一種免疫測定。免疫測定（immunoassay，IA）是應用免疫學技術測定標本的方法。在臨床檢驗中主要通過抗原抗體反應檢測體液中的抗體或抗原性物質。

1.1　抗原

　　抗原是能在機體中引起特異性免疫應答的物質?？乖M入機體后，可刺激機體產生抗體和引起細胞免疫。在免疫測定中，抗原是指能與抗體結合的物質。能在機體中引起抗體產生的抗原多為分子量大于5000的蛋白質。小分子化合物在與大分子蛋白質結合后能引起機體產生特異性抗體的，稱為半抗原（hapten）。例如某些激素、藥物等?？乖姆磻匀Q于抗原決定簇（antigenic determinant），或稱為表位（epitope）。一個抗原分子可帶有不同的決定簇。

1.2　抗體

1.2.1　抗體的結構

　　抗體是能與抗原特異性結合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五類，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測定有關的Ig主要為IgG和IgM。Ig由兩個輕鏈（L）和兩個重鏈（H）的單體組成。Ig的輕鏈是相同的，有κ（kappa）和λ（Lambda）兩種型別。五類Ig的重鏈結構不同，這決定了它們的抗原性也不同。IgG和IgM的重鏈分別稱為γ（gamma）鏈和μ（mu）鏈。

　　重鏈和輕鏈的N端的氨基酸排列順序因各種抗體而異，稱為可變區(qū)，分別用VH和VL表示。兩者構成抗體的抗原結合部位，只與相應的抗原決定簇匹配，發(fā)生特異性結合，是抗體專一性結合抗原的結構基礎。

　　IgG可被木瓜蛋白酶分解為三個區(qū)段，其中兩個相同的區(qū)段稱抗原結合片段（Fab）。每個Fab都保存結合抗原的能力，但只有一個抗原結合位點，是單價的，與抗原結合后不出現(xiàn)凝集或沉淀。另一區(qū)段稱Fc段，無抗體活性，但具有IgG*

的抗原性。

　　IgG可被Pepsin分解為兩個片段，一個Fab雙體，稱F（ab'）2，能和兩個相同的抗原結合；另一片段類似Fc，隨后被分解成小分子多肽，無生物活性。

　　IgM是由五個單體組成的五聚體，含10個重鏈和10個輕鏈，具有10個抗原結合價，由于空間位置的影響，只表現(xiàn)為五個抗原結合價。IgM分子量約為900000，IgG分子量約為150000。

機體被微生物感染后，先產生IgM抗體，然后產生IgG抗體。經過一段時間，IgM抗體量逐漸減少而消失，而IgG抗體可長期存在，在疾病結束后可持續(xù)數(shù)年之久。

IgM抗體一般為保護性抗體，具有免疫性。因此IgM抗體的測定，對某些傳染病如甲型肝炎有較高的臨床診斷價值。

1.2.2 　抗體的產生

　　機體受抗原刺激后，B淋巴細胞產生相應的抗體。含有抗體的血清稱為抗血清（antiserum）。每一系B細胞只產生針對某一抗原決定簇的抗體。如將多種抗原或含有多個抗原決定簇的抗原注入機體，則將由多系的B細胞產生相應的多種抗體，這些抗體均存在于免疫血清中。免疫測定中所用的抗血清一般用抗原免疫兔、羊或馬制得。產生抗體的B細胞可在體外與繁殖力強的腫瘤細胞融合成雜交瘤細胞。將單個雜交瘤細胞分離，在體內或體外培養(yǎng)而分泌的抗體單克隆抗體（monoclonal antibody，McAb或Mab）。單克隆抗體僅針對一種抗原決定簇，具有很高的特異性。單克隆抗體通常用抗原免疫小鼠制備。將免疫的脾細胞（含產生抗體的B細胞）與小鼠腫瘤細胞融合，分離雜交瘤細胞，接種于小鼠腹腔，產生的腹水中含有濃度很高的單克隆抗體。

1.3　抗原抗體反應

1.3.1　可逆性   抗原與抗體結合形成抗原抗體復合物的過程是一種動態(tài)平衡，其反應式為：Ag+Ab→Ag·Ab。.抗體的親和力（affinity）是抗原抗體間的固有結合力，可以平衡常數(shù)K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]。Ag·Ab的解離程度與K值有關。高親和力抗體的抗原結合點與抗原的決定簇在空間構型上非常適合，兩者結合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結構和活性，因此可用親和層析法來提純抗原或抗體。在抗血清中，特異性的IgG抗體僅占總IgG中的極小部分。用親和層析法提取的特異性抗體，稱為親和層析純抗體，應用于免疫測定中可得到更好的效果。

1.3.2　最適比例   在恒定量的抗體中加入遞增量的抗原形成抗體復合物（沉淀）的量見圖1-4。曲線的高峰部分是抗原抗體比例最合適的范圍，稱為等價帶（zone of equivalence）。在等價帶前后分別為抗體過剩帶和抗原過剩帶。如果抗原或抗體極度過剩，則無沉淀物形成，在免疫測定中稱為帶現(xiàn)象（zone phenomenon）?？贵w過量稱為前帶（prezone），抗原地過量稱為后帶（postzone）。在用免疫學方法測定抗原時，應使反應系統(tǒng)中有足夠的抗體量，否則測得的量會小于實際含量，甚至出現(xiàn)假陰性。

1.3.3　特異性   抗原抗體的結合實質上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結合位點之間。由于兩者在化學結構和空間構型上呈互補關系，所以抗原抗體反應具有高度的特異性。例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗體（HBcAg），雖來源于同一病毒，但僅與其相應的抗體結合，而不與另外兩種抗體反應?？乖贵w反應的這種特異性使免疫測定能在一非常復雜的蛋白質化合物（例如血清）中測定某一特定的物質，而不需先分離待檢物。

　　但是這種特異性也不是絕對的。假使兩種化合物有著部分相同的結構，在抗原抗體反應中可出現(xiàn)交叉反應。例如：絨毛膜hCG和黃體生成激素（LH）均由α和β兩個亞單位組成，其結構的不同處在β亞單位，而兩者的α亞單位是同類的。用hCG免疫動物所得的抗血清中含有抗α-hCG和抗β-hCG兩種抗體，抗α-hCG抗體將與LH發(fā)生交叉反應。在臨床檢驗中，如用抗hCG抗血清作為妊娠診斷試劑檢定尿液中hCG，只能用于hCG濃度較高的試驗，否則婦女生理性排泄入尿液中的微量LH將與之發(fā)生交叉反應。因此在作為早孕診斷（敏感度應達到50mIu/mlhCG）的實際中必須應用只對hCG特異的抗β-hCG，以避免與其它激素的交叉反應的發(fā)生。

1.3.4　敏感性   在測定血清中某一物質的含量時，化學比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應測定法的敏感度約為5~10μg/ml，免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應法相仿。標記的免疫測定的敏感度可提高數(shù)千倍，達ng/ml水平。例如，用放射免疫測定法或酶免疫測定法測定HBsAg，其敏感度可達0.1ng/ml。

1.4　免疫測定在臨床檢驗中的應用

　　由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標本中相應的抗原，因此免疫測定的應用范圍極廣，在臨床檢驗中可用于測定：

    1) 體液中的各種蛋白質，包括含量極少的蛋白質如甲胎蛋白等。

    2) 激素，包括小分子量的甾體激素等。

    3) 抗生素和藥物。

    4) 病原體抗原，HBsAg、HBeAg等。

    5) 另外，也可利用純化的抗原檢測標本中的抗體，例如抗-HBs等。

1.5． 標記的免疫測定

　　如上所述，免疫測定是一種很敏感的測定方法，抗原抗體反應后直接測定形成的沉淀或濁度，敏感度可達5~10μg/ml，但在臨床檢驗中，某些待測物在標本中的含量遠低于這一水平，因此要尋找增加敏感度的方法。標記的免疫測定是將檢測試劑中的抗原或抗體用可微量測定的物質加以標記，通過測定標記物來提高敏感度。在放射免疫測定和酶免疫測定中，標記物分別為放射性核素和酶，最后用測定放射性和酶活力來計算待檢物的量，敏感度可比直接測定沉淀物提高數(shù)百至數(shù)千倍。在標記免疫測定中，一般加入過量的標記試劑以保證與待測物*反應。以標記抗體（Ab※）檢測抗原（Ag）為例，反應式如下：Ag+ Ab※ → AgAb※+ Ab※。在反應產物中有與Ag結合的Ab※和游離和Ab※，如不將兩者分離而測定標記物，測得的結果將為兩者之和。因此，游離標記物與結合標記物的分離是標記免疫測定中的重要步驟。可采用多種手段，固相載體是其中之一。如將抗原或抗體包被在固相載體上，然后再與標記的抗原或抗體直接反應，結合的標記物被固定在載體上，而游離的標記物留于溶液中。這樣可以通過洗滌將游離的Ab※除去，結合標記物的測定可在固相上進行。

1.6．酶免疫測定

　　酶免疫測定（enzyme immunoassay）可分為均相（homogenous）和非均相（heterogenous）兩種類型。在均相EIA中可不需進行游離的和結合的標記物的分離而直接測定標記物。例如在某種條件下，抗原抗體反應后形成的酶標記抗原抗體復合物中的酶失去其對底物作用的活力，因而測出的酶活力直接反映游離的酶標記物。均相EIA在臨床檢驗中較少應用。非均相EIA需先進行游離的和結合的標記物的分離。如前所述，固相載體可用作一種分離手段。這種固相酶免疫測定方法在1971年最初建立時稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay），簡稱ELISA，在國內有譯作酶聯(lián)免疫吸附試驗或酶標，已習用。