人甘丙肽（GL）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒
實(shí)驗(yàn)原理
本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。在預(yù)包被抗人髓系細(xì)胞觸發(fā)受體
-1 （TREM-1）抗體（固相抗體）的微孔酶標(biāo)板中，加入人髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1 （TREM-1）
校準(zhǔn)品和待測(cè)樣本，再加入另一株 HRP 標(biāo)記的抗人髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1 （TREM-1）抗體（酶
標(biāo)抗體），經(jīng)過(guò)溫育與充分洗滌，去除未結(jié)合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體-抗原-
酶標(biāo)抗體的夾心復(fù)合物。加底物 A 和 B，底物在 HRP 催化下，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，在終止液（2M 硫
酸）作用下，最終轉(zhuǎn)化為黃色，在酶標(biāo)儀 450nm 波長(zhǎng)上測(cè)定吸光度（OD 值），吸光度（OD 值）
與待測(cè)樣品中人髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1 （TREM-1）的濃度正相關(guān)。擬合校準(zhǔn)品曲線，可以計(jì)算
出樣本中人髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1 （TREM-1）的濃度。
試劑盒限制性
1、僅供科研使用，不得用于臨床診斷。
2、在試劑盒標(biāo)示的有效期內(nèi)使用，過(guò)期產(chǎn)品不得使用。
3、跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。
4、使用試劑盒配套的樣品稀釋液。
5、如果樣本值高于最高標(biāo)準(zhǔn)品濃度值，請(qǐng)將樣本適當(dāng)稀釋后，再重新測(cè)定。
6、待測(cè)樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)前，請(qǐng)排出該因素。
7、通過(guò)其他方法得到的檢測(cè)結(jié)果，與本試劑盒測(cè)定結(jié)果不具有直接的可比性。
技術(shù)提示
1、混合蛋白溶液時(shí)，避免起泡。
2、加校準(zhǔn)品與樣本時(shí)，每個(gè)校準(zhǔn)品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應(yīng)該懸臂加樣，
避免交叉污染。
3、合適的溫育時(shí)間，和充分的洗滌步驟，是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的必要條件。
4、使用自動(dòng)洗板機(jī)時(shí)，加入一個(gè) 30 秒浸泡的步驟，可以提高檢測(cè)精度。
5、底物溶液為無(wú)色液體，保存過(guò)程中變?yōu)樗{(lán)色，代表底物溶液已經(jīng)失效，不得使用。
6、終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后，藍(lán)色底物產(chǎn)物，會(huì)瞬間變?yōu)辄S
色。
7、實(shí)驗(yàn)中，用剩的板條，應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
8、所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)標(biāo)明的時(shí)間、加樣量及加樣順序進(jìn)行溫
育操作
人甘丙肽（GL）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒
試劑盒組分與保存
未開(kāi)封的試劑盒保存在 2-8 度，不得使用過(guò)期試劑盒。
組分
數(shù)量
主要成分
開(kāi)封后儲(chǔ)存
校準(zhǔn)品
0.3ml/管
--
2-8℃14 天
包被微孔板
96T/48T
預(yù)包被固相抗體
2-8℃14 天
HRP 標(biāo)記抗體
10mL
HRP 標(biāo)記的檢測(cè)抗體
2-8℃14 天
樣本稀釋液
6mL
--
2-8℃180 天
底物液 A
6mL
0.01%過(guò)氧化氫
2-8℃180 天
底物液 B
6mL
0.1%TMB
2-8℃180 天
終止液
6mL
2mol/L 稀硫酸
2-8℃180 天
20×濃縮洗滌液
25mL
0.05%Tween20
2-8℃180 天
說(shuō)明書(shū)
1 份
--
--
自封袋
1 個(gè)
--
--
不干膠
2 片
--
--
校準(zhǔn)品濃度依次為：240、 120、 60、 30、 15、 7.5 pg/mL。
其他用品
1、酶標(biāo)儀（450nm）
2、精密移液器及一次性吸頭
3、蒸餾水
4、洗瓶或者自動(dòng)洗板機(jī)
5、37℃水浴鍋或恒溫箱
6、500ml 量筒
生物安全
1、檢測(cè)必須符合實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范的規(guī)定，嚴(yán)格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄
物都應(yīng)按照傳染物進(jìn)行處置。
2、試劑盒的液體組分中，含有 proclin-300 防腐劑，可能引起皮膚過(guò)敏反應(yīng)，避免吸入煙霧
與皮膚接觸。
3、底物液對(duì)皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入煙霧。
4、戴上防護(hù)手套，實(shí)驗(yàn)完成后*洗手。僅供科研使用，不得用于臨床診斷。
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樣品的采集和儲(chǔ)存
以下只是列出樣品采集和保存的一般指南。所有樣本采集保存過(guò)程中，不得使用疊氮鈉
做為防腐劑。
1、細(xì)胞培養(yǎng)上清：4000rpm 條件下離心 20min，去除細(xì)胞顆粒和聚合物，上清液保存在- 20℃
以下，避免反復(fù)凍融。
2、血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激，4000rpm 條件下離
心 20min，小心地分離出血清，保存在-20℃以下，避免反復(fù)凍融。
3、血漿：肝素，EDTA，或檸檬酸鈉作為抗凝劑。在 4000rpm 條件下，離心 20 分鐘取上清，
血漿保存在-20℃以下，避免反復(fù)凍融。
樣本收集后，無(wú)法一次檢測(cè)完畢，請(qǐng)按一次用量分裝凍存，避免反復(fù)凍融，使用時(shí)在室溫
下解凍，確保樣品均勻充分解凍。
4、組織勻漿：用預(yù)冷的 PBS (0.01 M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎。
將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的 PBS(一般按 1: 9 的重量體積比，比如 1g 的組織樣品對(duì)應(yīng) 9 mL
的 PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在 PBS 中加入蛋白酶抑制
劑)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行
超聲破碎或反復(fù)凍融。最后將勻漿液 5000×g 離心 5-10 分鐘，取上清檢測(cè)。
5、細(xì)胞提取液：貼壁細(xì)胞用冷的 PBS 輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g 離心 5 分鐘
后收集細(xì)胞；懸浮細(xì) 胞可直接離心收集。收集的細(xì)胞用冷的 PBS 洗滌 3 次。每 1×106 個(gè)
細(xì)胞中加入 150-200μLPBS 重懸并通過(guò)反復(fù)凍融使細(xì)胞破碎(若含量很低可減少 PBS 的體
積)。將提取液于 1500×g 離心 10 分鐘，取上清檢測(cè)。
6、其他生物體液：1000×g 離心 20 分鐘，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測(cè)。
試劑準(zhǔn)備
1、使用前，所有的組分都要至少?gòu)?fù)溫 60min，確保充分復(fù)溫到室溫。
2、濃縮洗滌液：從冰箱取出的濃縮洗滌液，會(huì)有結(jié)晶產(chǎn)生，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)
晶*溶解。濃縮洗滌液與蒸餾水，按 1:20 稀釋，即 1 份的濃縮洗滌液，添加 19 份的蒸
餾水。
3、底物：底物液 A 和 B，在使用前，按 1:1 體積充分混合，混合后 15 分鐘內(nèi)使用。
僅供科研使用，不得用于臨床診斷。
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操作程序
所有試劑和組分都先恢復(fù)到室溫，標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品，建議做復(fù)孔。
1、按前面說(shuō)明書(shū)描述的方法，配制好試劑盒各種組分的工作液。
2、從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。
設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、0 值孔、空白孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 50μL，0 值
孔加樣本稀釋液 50μL，空白孔不加，樣本孔加待測(cè)樣本 50μL。
3、除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔、0 值孔和樣本孔，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體
100μL。
4、用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育 60min。
5、揭開(kāi)封板膜，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置 20S，甩去洗滌液，吸水
紙上拍干，如此重復(fù) 5 次。若使用自動(dòng)洗板機(jī)，請(qǐng)按洗板機(jī)操作程序進(jìn)行洗板，添加浸泡
30s 的程序，可以提高檢測(cè)的精度。洗板結(jié)束，加底物前，要在干凈不掉屑的紙上，充分
拍干反應(yīng)板。
6、將底物 A 和 B 按 1:1 體積充分混合，所有孔中加入底物混合液 100μL。用封板膜蓋住反
應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育 15min。
7、所有孔加入終止液 50μL，在酶標(biāo)儀上讀取各孔吸光度（OD 值）。
