一、永生化小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞簡介：雖然原代小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞更能真實(shí)地反映肝竇內(nèi)皮細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生理狀態(tài)，但是一方面原代分離培養(yǎng)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞周期長和對實(shí)驗(yàn)設(shè)備、試劑及技術(shù)人員經(jīng)驗(yàn)要求較高，另一方面此原代細(xì)胞在體外的生長增殖能力非常緩慢有限，以至于此細(xì)胞不能傳代，這些不利因素制約了原代小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室的廣泛應(yīng)用
一、永生化小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞簡介：
雖然原代小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞更能真實(shí)地反映肝竇內(nèi)皮細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生理狀態(tài)，但是一方面原代分離培養(yǎng)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞周期長和對實(shí)驗(yàn)設(shè)備、試劑及技術(shù)人員經(jīng)驗(yàn)要求較高，另一方面此原代細(xì)胞在體外的生長增殖能力非常緩慢有限，以至于此細(xì)胞不能傳代，這些不利因素制約了原代小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室的廣泛應(yīng)用。我公司的研究團(tuán)隊(duì)擁有多年原代細(xì)胞分離培養(yǎng)及細(xì)胞永生化服務(wù)研究經(jīng)驗(yàn)，成功建立了永生化小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞。
肝血竇是相鄰肝板之間的腔隙，是一種特殊的毛細(xì)血管。肝血竇的竇壁由肝細(xì)胞的細(xì)胞膜構(gòu)成，故肝血竇的通透性較大，有利于肝細(xì)胞與血流之間進(jìn)行物質(zhì)交換。在電鏡下觀察，肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞與肝細(xì)胞之間有一狹窄間隙，稱竇周隙(Disse腔)。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞是肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的主要細(xì)胞群，由肝竇內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的肝竇壁是全身毛細(xì)血管壁中缺乏基膜的毛細(xì)血管窗孔，足肝竇內(nèi)皮細(xì)胞特征性的結(jié)構(gòu)。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞在調(diào)節(jié)肝竇血流與周圍組織的物質(zhì)交換中起有效的中樞性的作用，因此肝竇內(nèi)皮細(xì)胞對于維持正常的肝功能起十分重要的作用。同時(shí)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞在肝臟的生理病理過程中發(fā)揮著諸多的重要功能。
本公司生產(chǎn)的永生化小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞采用體外灌注和密度梯度離心法和基因轉(zhuǎn)染制備而來，細(xì)胞總量約為1×106/T25方瓶，細(xì)胞純度可達(dá)95%以上，且不含有HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。
二、 使用方法
1 、您收到細(xì)胞后，請按照以下方法進(jìn)行操作：
取出 T25 方瓶， 75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶，拆下封口膜，放入 37℃ , 5%CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置 2-3 小時(shí)， 以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，然后打開瓶子回收瓶子中培養(yǎng)液作為后續(xù)培養(yǎng)此細(xì)胞的培養(yǎng)液（備注： 先使用瓶子中培養(yǎng)液培養(yǎng)及盡快凍存保種細(xì)胞， 保存種子后再嘗試自己完全培養(yǎng)液培養(yǎng)觀察是否適合此細(xì)胞生長，以免使用自己培養(yǎng)液不適合細(xì)胞生長造成細(xì)胞狀態(tài)不好或死亡） ，最后按照后面細(xì)胞傳代步驟進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。
2 、細(xì)胞傳代：
1）細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的 90%面積時(shí)，棄 T25 方瓶中的培養(yǎng)液， 用 PBS 清洗細(xì)胞 3 次；
2）添加 0.25%消化液約 2ml 至培養(yǎng)瓶中 37 度培養(yǎng)箱放置 3-5 分鐘，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞基本脫落后加入培養(yǎng)基終止消化，用滴管混勻并將懸液轉(zhuǎn)移至 15ml 離心管中，1000rpm/min，離心 5min；
3）棄上清，沉淀細(xì)胞用 10ml 培養(yǎng)基重懸，然后按 1:2 比例進(jìn)行分瓶傳代， 最后放入 37℃ ,5%CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4）待細(xì)胞貼壁后， 觀察培養(yǎng)結(jié)果，之后進(jìn)行換液培養(yǎng)或傳代。
3 、細(xì)胞凍存：
1）細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的 90%面積時(shí)，棄 T25 方瓶中的培養(yǎng)液，用 PBS 清洗細(xì)胞 3 次；
2）添加 0.25%消化液約 2ml 至培養(yǎng)瓶中 37 度培養(yǎng)箱放置 3-5 分鐘，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞基本脫落后加入培養(yǎng)基終止消化，用滴管混勻并將懸液轉(zhuǎn)移至 15ml 離心管中，1000rpm/min，離心 5min；
3）用適當(dāng)量的凍存液（培養(yǎng)液： FBS：DMSO=7:2:1）重懸細(xì)胞，并放置于凍存管中；
4）先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃ 1h，然后將其移入-80℃過夜， 24h 后轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行長期儲存（或者按照梯度程序降溫模式直接放置-80 度凍存后并轉(zhuǎn)移液氮中長期儲存）。
4、細(xì)胞復(fù)蘇：
1）從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具） ，快速將其置入 37℃水浴中解凍， 直至凍存管中無結(jié)晶，然后用 75%的酒精擦拭凍存管外壁； 2）將凍存管中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含 5ml 培養(yǎng)液無菌離心管中，1000rpm 離心 5min ，然后加入 5ml 完全培養(yǎng)液混勻細(xì)胞， 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至 T25 培養(yǎng)瓶中， 放置于 37℃ , 5%CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
3）第二天，換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
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