激光熒光共聚焦顯微鏡輸出的激光通過(guò)照明針孔反射到物鏡上，再通過(guò)分色鏡，最后聚焦在樣品表面。激光將與生物組織樣品中的熒光物質(zhì)相互作用，產(chǎn)生熒光。一些熒光信號(hào)將以與入射光路相反的方向通過(guò)物鏡，然后進(jìn)入分光鏡，最后被檢測(cè)器收集。由于針孔和樣品焦平面之間的共軛關(guān)系，焦平面外的反射信號(hào)會(huì)被針孔過(guò)濾掉，這使得共聚焦顯微鏡具有一定的色譜能力。穿過(guò)針孔的熒光信號(hào)具有很強(qiáng)的色譜能力。同時(shí)，由于光線(xiàn)強(qiáng)度較弱，需要使用靈敏度高的光電探測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。光電倍增管可以將熒光信號(hào)放大并轉(zhuǎn)換為電信號(hào)（光電探測(cè)器輸出的電信號(hào)強(qiáng)度與熒光強(qiáng)度成正比），然后傳輸給計(jì)算機(jī)，計(jì)算機(jī)通過(guò)特定的處理方法將電信號(hào)轉(zhuǎn)換為圖像信息。
激光熒光共聚焦顯微鏡技術(shù)的主要應(yīng)用范圍如下：
1、組織和細(xì)胞中的熒光定量測(cè)定
常用于單活細(xì)胞水平的定量分析，如原位雜交、腫瘤細(xì)胞凋亡觀(guān)察、DNA損傷和修復(fù)。
2、細(xì)胞間通訊的研究
用于研究縫隙連接通訊在胚胎發(fā)生、生殖發(fā)育、神經(jīng)生物學(xué)、腫瘤發(fā)生等過(guò)程中的基本機(jī)制和功能，也可用于鑒定對(duì)縫隙連接有潛在毒性的化學(xué)物質(zhì)。
3、細(xì)胞的物理和化學(xué)測(cè)定
可以定量、定性、定時(shí)、定點(diǎn)地測(cè)定溶酶體、線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞骨架、結(jié)構(gòu)蛋白、DNA、RNA、酶、受體分子等細(xì)胞內(nèi)特定結(jié)構(gòu)的含量、組成和分布。
4、細(xì)胞內(nèi)鈣離子和pH值的動(dòng)態(tài)分析
激光熒光共聚焦顯微鏡利用熒光探針和激光掃描共聚焦顯微鏡，可以測(cè)量活細(xì)胞內(nèi)pH值和多種離子（Ca2+、K+、Na+、Mg2+）的濃度和變化。
5、三維圖像的重建
6、熒光漂白恢復(fù)技術(shù)
經(jīng)過(guò)熒光漂白的細(xì)胞在熒光恢復(fù)過(guò)程中的變化，可以用來(lái)分析細(xì)胞的生物過(guò)程，如蛋白質(zhì)的運(yùn)輸、細(xì)胞膜上受體的流動(dòng)和大分子的組裝。
