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大兔原代晶狀體上皮細(xì)胞培養(yǎng)
PriCells - 正常大兔原代晶狀體上皮細(xì)胞培養(yǎng)
一、實(shí)驗(yàn)試劑
1、培養(yǎng)基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement
2、凍存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO
3、洗滌液： 1 × PBS （pH 7.4 ）+ 1% P/S
4、檢測(cè)試劑：抗兔Vimentin抗體，熒光標(biāo)記二抗，乙醇丙酮混合液（1：1）
二、實(shí)驗(yàn)器械
1、培養(yǎng)皿
2、培養(yǎng)瓶
3、直剪和眼科剪
4、眼科鑷
5、200μl微量移液器及200μl的吸頭
6、玻璃滴管
三、實(shí)驗(yàn)流程
取材
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清除鞏膜外肌肉及結(jié)締組織
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將眼球浸入含1×P/S 1 × PBS （pH 7.4 ）浸泡5min
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再用1 × PBS （pH 7.4 ）沖洗3遍
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在超凈臺(tái)中環(huán)形剪除角膜，放射狀剪開(kāi)并撕除虹膜
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用眼科鑷盡量靠近赤道部撕下晶體前囊膜
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將前囊膜剪成1mm×1mm大小的碎片
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用吸頭吸取組織塊接種于培養(yǎng)瓶中，每小塊間距0.5cm左右。
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翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，瓶底朝上，加入2ml培養(yǎng)基
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培養(yǎng)瓶倒置在培養(yǎng)箱中，干貼壁2-4h
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培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，繼續(xù)靜置培養(yǎng)，48h后換液
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觀察到細(xì)胞爬出后，將組織塊去除
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繼續(xù)放置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中。
四、實(shí)驗(yàn)操作
1、培養(yǎng)瓶預(yù)包被。試驗(yàn)前一天預(yù)包培養(yǎng)瓶，置于超靜臺(tái)吹干或45℃烘箱烘干（切記保持無(wú)菌），4℃冰箱放置，備用。
2、取材：首先在無(wú)菌條件下清除鞏膜外肌肉及結(jié)締組織后將眼球浸入含1×P/S PBS浸泡5min。
3、材料預(yù)處理：用1 × PBS （pH 7.4 ）沖洗3遍，在超凈臺(tái)中環(huán)形剪除角膜放射狀剪開(kāi)并撕除虹膜，充分暴露晶狀體赤道部，用眼科鑷盡量靠近赤道部撕下晶體前囊膜，將前囊膜剪成1mm×1mm大小的碎片。
4、組織貼塊：取200μl的吸頭一只，在酒精燈上用火焰燒彎。用槍頭吸取組織塊接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶20－25塊左右，每小塊間距0.5cm左右。
5、貼壁處理：組織塊放置好后，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，讓瓶底朝上，向瓶?jī)?nèi)加入2ml左右的培養(yǎng)液，蓋好瓶蓋，將培養(yǎng)瓶倒置在培養(yǎng)箱中，干貼壁2-4h。
6、培養(yǎng)：干貼壁完成后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，繼續(xù)靜置培養(yǎng)；48h后換液，更換2-3ml即可。
7、組織塊去除：貼塊貼壁培養(yǎng)4-7d后，在鏡下觀察可見(jiàn)大量細(xì)胞爬出，用吸管將組織塊吹下、去除，繼續(xù)放置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中。
五、細(xì)胞鑒定
1、顯微鑒定：相差顯微鏡下，可見(jiàn)細(xì)胞呈體積較細(xì)小呈類(lèi)圓形透明狀。細(xì)胞具備良好的透光性，傳代后一經(jīng)貼壁就鋪呈多種形態(tài)生長(zhǎng)。
2、免疫組織化學(xué)鑒定 ：利用Vimentin免疫熒光染色檢測(cè)
3、細(xì)胞爬片。將洗凈的蓋玻片放入6孔培養(yǎng)板中，接種細(xì)胞為3×104個(gè)/孔，48小時(shí)候細(xì)胞可以長(zhǎng)滿，用鑷子取出鋪滿細(xì)胞的蓋玻片備用。
4、細(xì)胞固定：用1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌細(xì)胞，之后放入乙醇丙酮混合液中，固定10min，空氣中自然干燥。
5、特異性抗體：按照說(shuō)明書(shū)稀釋比要求稀釋抗體，加入抗體，放置37℃孵育60min。
6、洗滌：1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次 × 15 分鐘，晾干。
7、標(biāo)記性抗體：加入熒光標(biāo)記抗體，37℃孵育30min。
洗滌：1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次 × 15 分鐘，晾干。
8、封片：封片劑封片。
9、鏡檢：熒光顯微鏡下觀察。
六、注意事項(xiàng)
1、材料預(yù)處理時(shí)要注意小心，不要破壞晶狀體結(jié)構(gòu)，要注意晶狀體前后，確保撕取的是前囊膜。
2、將組織塊貼于培養(yǎng)瓶中后，對(duì)于培養(yǎng)瓶的移動(dòng)，翻轉(zhuǎn)，加液等動(dòng)作一定要輕柔，以免使組織塊浮起。
3、去除組織塊的時(shí)機(jī)要選擇好，去除過(guò)早，細(xì)胞數(shù)量太少，會(huì)使細(xì)胞生長(zhǎng)速度變慢，去除時(shí)間太晚，會(huì)使部分區(qū)域細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)密，導(dǎo)致細(xì)胞老化，影響細(xì)胞狀態(tài)。
4、嚴(yán)格控制上皮細(xì)胞培養(yǎng)條件。包括細(xì)胞培養(yǎng)用液（培養(yǎng)基，生長(zhǎng)因子，血清，抗生素）的質(zhì)量，濃度。
5、關(guān)于培養(yǎng)瓶包被與否，有文獻(xiàn)研究顯示包被與未包被之間沒(méi)有特別大的差異。 實(shí)驗(yàn)中，可以酌情考慮是否包被。
6、傳代培養(yǎng)細(xì)胞接種量為5×104個(gè)（25 cm2培養(yǎng)瓶），細(xì)胞倍增時(shí)間為48小時(shí)。細(xì)胞傳代培養(yǎng)最佳為3-5代，5代后晶體上皮細(xì)胞明顯成纖維細(xì)胞化，呈梭形或條狀，細(xì)胞大小不等，細(xì)胞相互分離形成拉網(wǎng)現(xiàn)象，傳代消化時(shí)間會(huì)有所延長(zhǎng)。
七、PriCells細(xì)胞圖片
