武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司

大鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)

時(shí)間:2021-9-10 閱讀:269
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    PriCells –正常大鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)
     
    一、實(shí)驗(yàn)試劑
    1、培養(yǎng)基: PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement
    2、凍存液: PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO
    3、洗滌液: 1×PBS(pH 7.4)+ 1% P/S
    4、染色液: 0.4% Trypan Blue
    5、消化液: PriCells Isolation of Primary Cell Kit
    6、檢測(cè)試劑:一抗小鼠抗大鼠α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白,二抗FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG,乙醇丙酮混合液(1∶1)
     
    二、實(shí)驗(yàn)器械
    1、培養(yǎng)皿
    2、培養(yǎng)瓶
    3、直剪和眼科剪
    4、眼科鑷
    5、200目網(wǎng)篩
    6、玻璃滴管
    7、燒杯
    8、15ml離心管
     
    三、實(shí)驗(yàn)流程
    取材
    取心肌組織放入D-Hanks中洗滌3次
    剪碎至1mm3+消化液(PriCells)
    37℃水浴8min,吸棄上層懸液(非心肌細(xì)胞)
     余下組織加消化液(PriCells) 37℃磁力攪拌10min,60r/min
    上層懸液加消化終止液(PriCells)
    余下組織再加消化液(PriCells)繼續(xù)消化3-5次
    收集所有混懸液過(guò)200目網(wǎng)篩
    收集濾液1000RPM/10min
    去上清,收集沉淀,2ml培養(yǎng)基重懸
    染色計(jì)數(shù)
    四、實(shí)驗(yàn)操作
    1、培養(yǎng)瓶預(yù)包被。試驗(yàn)前一天預(yù)包培養(yǎng)瓶,置于超靜臺(tái)吹干或45℃烘箱烘干(切記保持無(wú)菌),4℃冰箱放置,備用。
     
    2、取材:出生1—3天幼鼠。
     
    3、材料預(yù)處理:將獲取的心臟放入含有1% P/S的1×PBS(pH 7.4)中,剪去心房,反復(fù)洗滌,至心室內(nèi)無(wú)xue漬,洗滌液澄清為止。
     
    4、消化:將心室肌用眼科剪剪成1mm3大小組織塊,加入消化液10ml,37℃水浴8min后,吸取上層混懸液遺棄;余下組織加入消化液10ml,37℃水浴并用磁力攪拌器攪拌10min;吸取上層混懸液,終止反應(yīng);剩余沉淀物再加消化液消化3-5次,直至組織塊*消化。
     
    5、終止消化:按1∶1加入消化終止液,中止酶反應(yīng)。
     
    6、收集重懸細(xì)胞:收集中止后的消化液于離心管中,1000 rpm,離心10 min,棄去上清,加入培養(yǎng)液重懸,染色計(jì)數(shù)細(xì)胞。
     
    7、培養(yǎng)細(xì)胞密度:調(diào)整細(xì)胞密度以5 × 105個(gè)/ml 接種入培養(yǎng)瓶。
     
    8、培養(yǎng):放置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中。
     
    五、細(xì)胞鑒定
     
    1、顯微鑒定:接種后12h細(xì)胞形態(tài)變?yōu)樗笮位虿灰?guī)則扁平狀,24h后即可看到單個(gè)細(xì)胞的自發(fā)收縮,繼而細(xì)胞逐漸鋪展伸出偽足,形成不規(guī)則的星形,到第3~4天,細(xì)胞相互接觸交織成網(wǎng),形成細(xì)胞單層或細(xì)胞簇。
     
    2、免疫組織化學(xué)鑒定:利用α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白抗原檢測(cè)。
     
    3、細(xì)胞爬片。將洗凈的蓋玻片放入6孔培養(yǎng)板中,接種細(xì)胞為3×104個(gè)/孔,48小時(shí)候細(xì)胞可以長(zhǎng)滿,用鑷子取出鋪滿細(xì)胞的蓋玻片備用。
     
    4、細(xì)胞固定:用PBS洗滌細(xì)胞,之后放入乙醇丙酮混合液中,固定10min,空氣中自然干燥。
     
    5、特異性抗體:按照說(shuō)明書(shū)稀釋比要求稀釋抗體,加入抗體,放置4℃孵育過(guò)夜。
     
    6、洗滌:1×PBS(pH 7.4)洗滌3次×15分鐘,晾干。
     
    7、標(biāo)記性抗體:加入熒光標(biāo)記抗體,37℃孵育1h。
    洗滌:1×PBS(pH 7.4)洗滌3次×15分鐘,晾干。
     
    8、封片:封片劑封片。
     
    9、鏡檢:熒光顯微鏡下觀察,可見(jiàn)胞漿呈棕黃色染色,表明細(xì)胞對(duì)α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)呈陽(yáng)性。
     
    六、注意事項(xiàng)
     
    1、選用出生1-3d的幼鼠。
     
    2、在取出心臟之前給實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行消毒處理。
     
    3、采用多次消化,直到組織塊*消化,減少消化液對(duì)細(xì)胞的損傷。
     
    4、由于心肌細(xì)胞只占總細(xì)胞的25%,在接種心肌細(xì)胞之前做差速貼壁,除掉大部分成纖維細(xì)胞。
     
    5、初分離獲得的心肌細(xì)胞在生理濃度的鈣離子溶液中易喪失收縮活性, 為了保持心肌細(xì)胞的收縮功能, 在分離的過(guò)程中應(yīng)采用4℃的無(wú)鈣離子Hanks'緩沖液浸泡和沖洗心肌組織。
     
    七、PriCells細(xì)胞圖片


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