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PriCells: 磁珠法分離小鼠T細(xì)胞和B細(xì)胞
PriCells: 磁珠法分離小鼠T細(xì)胞和B細(xì)胞
基本方案
用AUTOMACS系統(tǒng)進(jìn)行總T細(xì)胞、CD4+細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞的自動(dòng)分離
實(shí)驗(yàn)材料
1、小鼠
2、HBSS洗滌緩沖液
3、MACS緩沖液
4、磁珠
5、RPMI-10*培養(yǎng)基
6、AUTOMACS系統(tǒng)和分選柱
7、30μm尼龍網(wǎng)或40μm預(yù)分離濾膜
實(shí)驗(yàn)方法
1、用5只小鼠的淋巴結(jié)或2只小鼠的脾臟制備單細(xì)胞懸液并去除紅細(xì)胞。
2、細(xì)胞在10mlHBSS洗滌緩沖液中混懸后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。
3、細(xì)胞懸液在4℃，200g離心10min。棄上清后將沉淀按每108個(gè)細(xì)胞0.9ml MACS緩沖液的比例混懸。每108個(gè)細(xì)胞加入0.1ml適當(dāng)?shù)拇胖楹笤?℃孵育15min。
4、在孵育的時(shí)間里，打開(kāi)AUTOMACS系統(tǒng)電源。按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中操作規(guī)程運(yùn)行清潔程序。
5、細(xì)胞懸液在4℃，200g離心10min。棄上清，在沉淀中加入足量的MACS緩沖液使細(xì)胞濃度達(dá)到108個(gè)細(xì)胞/ml，充分混懸。將細(xì)胞通過(guò)30μm尼龍網(wǎng)或40μm預(yù)分離濾膜。用0.1～0.4mlMACS緩沖液沖洗濾網(wǎng)。
6、細(xì)胞放到AUTOMACS的上樣通道。選擇possel程序，這樣標(biāo)記的細(xì)胞將從陽(yáng)性通道洗脫。
7、細(xì)胞懸液在4℃，200g離心10min。棄上清后將沉淀用2～5ml RPMI-10*培養(yǎng)基混懸。計(jì)數(shù)。
附錄：
RPMI*培養(yǎng)基：
RPMI1640培養(yǎng)基含有:
2%、5%、10%、15%或20%FBS,56℃熱滅活1h
2μmmol/L L-谷氨酰胺
50μmol/ml 2-ME
100U/ml 青霉素
100μg/ml 硫酸鏈霉素
RPMI-10*培養(yǎng)基：
配制RPMI*培養(yǎng)基加入:
10%（V/V）FBS
1mmol/L 丙酮酸鈉
50μg/ml慶大霉素
10mmol/L HEPES
4℃可保存2周
過(guò)濾除菌
HBSS洗滌緩沖液：
HBSS，含有：
5%（V/V）FBS
20mmol/L HEPES，pH7.0
100U/ml 青霉素
100μg/ml 鏈霉素
4℃可保存1個(gè)月
MACS緩沖液：
PBS，pH7.2
0.5%（m/V）BSA
2mmol/L EDTA
過(guò)濾除菌
用于自動(dòng)MACS系統(tǒng)，室溫儲(chǔ)存1個(gè)月
用于LS或LD柱時(shí)，脫氣，4℃保存