PriCells: 正常人乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)

實驗材料：

1. 人哺乳期早期或斷奶后乳汁。

2. 培養(yǎng)液：RPMI1640，15%FBS，10%人血清，50μg/ml霍亂毒素，0.5mg/ml氫化可de松，1mg/ml胰島素。

3. HuS（human serum）：血庫過期的血清，澳大利亞抗原陰性。5cm Nunc塑料培養(yǎng)皿。

4. 不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素和200000U/L慶大霉素，pH7.4。

5. 培養(yǎng)用液：1mg/ml胰島素（Sigma）：用6mmol/L鹽酸配制；0.5mg/ml氫化可de松：用生理鹽水配制；50μg/ml霍亂毒素（Schwartz-Mann）：用生理鹽水配制。

P.S：血清和儲存?zhèn)溆玫囊葝u素、氫化可de松、霍亂毒素、胰酶和胰蛋白酶應(yīng)在-20℃條件下保存。

6. 消化液（TEGPED）：胰蛋白酶液：加入13mmol/L EGTA 10ml，用PBSA配置。

7. 7 mmol/L EDTA：4ml，用PBSA配置。

8. 0.2%胰蛋白酶（Difco）：4ml，用HBSS配置。

9. 1%胰酶：2ml，用HBSS配置。

實驗方法：

1. 于產(chǎn)后2-7d收集乳汁。用無菌水擦洗乳房，將乳汁擠入無菌容器。將收集的乳汁混合后，用RPMI1640稀釋，以利于離心。

2. 將稀釋的乳汁離心（600-1000g，20min）后，輕輕吸去上清。為了避免影響沉淀細(xì)胞，應(yīng)留有少量液體。用含有5%FBS的RPMI1640洗細(xì)胞2-4次，直至上清不渾濁。

3. 用生長培養(yǎng)液混懸細(xì)胞，將50μl細(xì)胞懸液加入含6ml培養(yǎng)液的5cm培養(yǎng)皿中。在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞。

4. 3-5d后換液，以后每周換液2次，6-8d出現(xiàn)克隆。開始時，有巨噬細(xì)胞混雜生長，起著飼養(yǎng)細(xì)胞的作用?？寺≡龆嗪缶奘杉?xì)胞逐漸消失。

5. 傳代培養(yǎng)。細(xì)胞長滿底壁80%-85%時，可傳代。每個5cm培養(yǎng)皿1.5ml加入TEGPED，在37℃條件下用，孵育細(xì)胞5-15min。然后，混懸細(xì)胞。

6. 離心（100g，5min）后，用培養(yǎng)液混懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液稀釋3倍。將細(xì)胞懸液接種到培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，每3個培養(yǎng)皿或每1個培養(yǎng)瓶2ml。

7. PriCells-原代上皮細(xì)胞特制基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

8. PriCells-原代上皮細(xì)胞培養(yǎng)特制添加劑。

9. PriCells-原代細(xì)胞分離試劑盒。

    10. PriCells-原代細(xì)胞鑒定試劑盒。