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PriCells: 正常動(dòng)物肺肥大細(xì)胞的培養(yǎng)
PriCells: 正常動(dòng)物肺肥大細(xì)胞的培養(yǎng)
實(shí)驗(yàn)材料:
1. 正常動(dòng)物的肺組織;
2. 不含Ca2+和Mg2+的1×PBS,添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素,pH7.2;
3. TE液:Tyrode液加入2 mmol/L EDTA。Tyrode液含137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、0.36 mmol/L NaH2PO4、5.55 mmol/L 葡萄糖;
4. TEA液:TE液加入200mg/L氨芐青霉素、200mg/L慶大霉素和40mg/L甲硝唑;
5. TGMD液:Tyrode液加入0.1%明膠、1.23 mmol/L MgCl2和15mg/L DNA酶;
6. HA液:HEPES液補(bǔ)充0.25g/L不含脂肪酸的BSA。HEPES液含20 mmol/L HEPES、125 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl和0.5 mmol/L 葡萄糖;
7. HACM液HA液補(bǔ)充1 mmol/L CaCl2和1 mmol/L MgCl2;
8. 消化液a:用TE液配成,含有3g/L鏈霉蛋白酶和0.75g/L木瓜凝乳蛋白酶;
9. 消化液b:用TGMD液配成,含有1.5g/L膠原酶和0.15g/L彈性蛋白酶;
10. Percoll溶液:配成密度為1.090 g/ml、1.080 g/ml、1.070 g/ml和1.062 g/ml的4種溶液;
11. 培養(yǎng)液:ROMI1640,添加10%FBS、50μg/L SCF、2 mmol/L 谷氨酰胺、0.1 mmol/L 非必需氨基酸、100000 IU/L青霉素和100mg/L慶大霉素。pH7.2;
12. 手術(shù)刀、解剖剪、解剖鑷、眼科剪,眼科鑷,止血鉗,無菌消毒手術(shù)器械;
13. 離心管(15ml、50ml)
14. 網(wǎng)篩:300μm不銹鋼網(wǎng)篩
實(shí)驗(yàn)方法:
1. 取肺組織10—40g,放入4℃的TEA液中,剝除支氣管和血管后,將肺組織切成0.2—1g的小塊,用TEA液沖洗2次;
2. 將肺組織剪碎,加入消化液a,在室溫條件下消化20min。用孔徑為300μm不銹鋼篩網(wǎng)濾去已脫落下來的細(xì)胞。用TE液清洗組織塊,加入消化液a,將組織塊重復(fù)消化和過濾1次;
3. 用TGMD液清洗組織塊后,加入消化液b,在30℃條件下消化20min。用孔徑為300μm不銹鋼篩網(wǎng)濾出組織塊,收集濾液,在4℃條件下離心(400g,10min)。吸去上清液,用HA液混懸沉淀細(xì)胞,在4℃條件下保存;
4. 按操作步驟3重新操作1次,得到細(xì)胞懸液;
5. 將操作步驟3和4收集的細(xì)胞懸液混合,用孔徑為100μm不銹鋼篩網(wǎng)過濾,收集濾液,在4℃條件下離心(400g,10min)。然后,用4℃的HA液混懸沉淀細(xì)胞,再離心1次;
6. 用HACM液混懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度至0.5×106—2×106個(gè)/ml;
7. 在離心管中依次緩慢滴入密度為1.090 g/ml、1.080 g/ml、1.070 g/ml和1.062 g/ml的Percoll溶液。在1.062 g/ml的Percoll溶液中預(yù)先混入約1×107個(gè)細(xì)胞。然后,在20℃條件下離心(500g,40min);
8. 在密度1.070與1.080、1.080與1.090兩個(gè)Percoll溶液界面處收集細(xì)胞,用HA液混懸細(xì)胞,在4℃條件下離心(400g,10min)。然后,重復(fù)離心1次。
9. 用培養(yǎng)液混懸沉淀細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度至0.5×106—2×106個(gè)/ml,放37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后換液,以后每周換液1次;
10. PriCells-原代平滑肌細(xì)胞細(xì)胞特制基礎(chǔ)培養(yǎng)基;
11. PriCells-原代平滑肌細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)特制添加劑;
12. PriCells-原代細(xì)胞分離試劑盒;
13. PriCells-原代細(xì)胞鑒定試劑盒;