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不連續(xù)Nycodenz梯度溶液中原代細(xì)胞溶酶體的分離

時(shí)間:2021-11-5 閱讀:463
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PriCells: 不連續(xù)Nycodenz梯度溶液中原代細(xì)胞溶酶體的分離                               


試劑和器材: 
1.勻漿介質(zhì):0.25mol/L蔗糖溶液、1mmol/L乙二胺四乙酸、10mmol/L Hepes-NaOH,pH7.4;
2.NycoprepTM Universal;
3.磷酸緩沖液pH7.4(50mmol/L)
4.NycoprepTM Universal稀釋劑:6mmol/L乙二胺四乙酸、60mmol/L Hepes-NaOH,pH7.4;
5.Nycodenz工作溶液(500g/L):將5體積NycoprepTM Universal和1體積NycoprepTM Universal稀釋劑混合;
6.按要求向溶液中加入蛋白酶抑制劑;
7.線粒體組分;
8.超速離心機(jī),帶有配置約38ml容量離心管的吊桶式轉(zhuǎn)子(也可用較小的17ml或13ml離心管);
9.10ml規(guī)格注射器(內(nèi)徑大約0.8mm),帶金屬套管針;


實(shí)驗(yàn)方法:
所有操作在0—4℃下進(jìn)行。
1.用勻漿介質(zhì)對(duì)Nycodenz工作溶液進(jìn)行稀釋來(lái)產(chǎn)生Nycodenz濃度分別為300g/L、260g/L、240g/L和190g/L的梯度溶液,將這些溶液保持在0—4℃;
2.在勻漿介質(zhì)(4—10ml)中重懸沖洗過(guò)的線粒體沉淀,再與2倍體積Nycodenz工作溶液混合;
3.對(duì)于36—38ml的小管,在每個(gè)小管中用帶金屬套管針的注射器加8ml 190g/L Nycodenz于底層,從240g/L、260g/L和300g/L的Nycodenz各取7ml,再加入8—9ml線粒體沉淀混懸液;
4.在95000g下離心2h,然后從190g/L與240g/L Nycodenz界面上收集溶酶體或者在進(jìn)行標(biāo)記分析之前,分級(jí)收集全部梯度組分;

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