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PriCells: 原代細胞培養(yǎng)后,碘克沙醇梯度溶液分析主要細胞器

時間:2021-11-5 閱讀:304
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PriCells: 原代細胞培養(yǎng)后,碘克沙醇梯度溶液分析主要細胞器                              


試劑和器材: 
1. OptiPrepTM(600g/L的碘克沙醇);
2. 勻漿介質(zhì):0.25mmol/L蔗糖溶液、1mmol/L乙二胺四乙酸、20mmol/L Hepes-NaOH,pH7.4;
3. OptiPrepTM稀釋液:0.25mmol/L蔗糖、6mmol/L乙二胺四乙酸、120mmol/L Hepes-NaOH,pH7.4;
4. 碘克沙醇(500g/L)工作液(IWS):5體積OptiPrepTM +1體積OptiPrepTM稀釋液;
5. 按要求向勻漿介質(zhì)和OptiPrepTM稀釋液中加入蛋白酶抑制劑;
6. 使用勻漿介質(zhì)制備好的輕線粒體組分;
7. Dounce勻漿器(寬松配制,Wheaton B型);
8. 兩室梯度制備儀或Gradient MasterTM;
9. 5ml規(guī)格注射器(內(nèi)徑大約為0.8mm),帶金屬套管針;
10. 超速離心機,配有吊桶式轉(zhuǎn)子(離心管容量為17ml);
11. 梯度收集器,用來首先收集低密度或高密度的梯度液;


實驗方法:
   原代細胞培養(yǎng)后,所有操作均在0—4℃下進行。
1. 使用勻漿介質(zhì)稀釋碘克沙醇工作液,獲得碘克沙醇濃度為190g/L及270g/L的梯度溶液,將溶液置于冰上;
2. 使用寬松配制的Dounce勻漿器(用研杵研磨2—3次),在3.0ml的勻漿介質(zhì)中重懸輕線粒體沉淀;
3. 使用碘克沙醇工作液將混懸液碘克沙醇濃度調(diào)整到300g/L;
4. 使用兩室梯度制備儀或者Gradient MasterTM從兩種梯度溶液中各取6ml來制備線性梯度,置于可在吊桶式轉(zhuǎn)子中離心的管中;
5. 使用注射器和金屬套管針在梯度溶液下鋪入3—4ml在第3步制備的混懸液;
6. 在梯度溶液頂層鋪1—2ml勻漿介質(zhì)使得管中液面離頂部大約3mm,在適宜的吊桶式轉(zhuǎn)子中以大約70000g離心1.5—2h;
7. 可以用密度高的介質(zhì)來向上取代或者在凹液面上吸出來的方法先收集梯度溶液中1ml低密度部分?;蛘?,通過管刺破或小心地用細的金屬套管針探入管子的底部(與蠕動泵連接)來先收集密度高的組分;


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