水體eDNA技術的應用領域

生物多樣性研究：

Thomsen等[6]從丹麥的一個海洋生態(tài)系統(tǒng)中采集海水，利用環(huán)境DNA metabarcoding技術研究海洋魚類生物多樣性。在獲得的環(huán)境DNA中發(fā)現(xiàn)了15種不同的魚類，其中包括一些用傳統(tǒng)監(jiān)測方法很難發(fā)現(xiàn)的稀有物種。同時與9種傳統(tǒng)的海洋魚類調(diào)查方法比較，環(huán)境DNA檢測出的魚類多樣性與其他傳統(tǒng)方法相當，甚至優(yōu)于傳統(tǒng)方法。Thomsen等[10]研究表明從湖泊、池塘和河流的少量水樣中直接獲得DNA，可以檢測并定量分析研究區(qū)域內(nèi)及瀕危淡水動物(兩棲類、魚類、哺乳類、昆蟲類和甲殼類)多樣性。同時表明通過池塘水中分離的DNA，利用第二代測序技術可以檢測到研究區(qū)域內(nèi)兩棲類和魚類群體，環(huán)境DNA可以作為監(jiān)測瀕危物種的工具，應用于更廣泛的物種監(jiān)測中。

應用環(huán)境DNA metabarcoding技術不僅可以針對當前的生物多樣性進行有效的評估，也可以對過去的動植物群落的多樣性進行評估[11, 45]。Epp等[11]通過對過去和現(xiàn)在的環(huán)境DNA進行metabarcoding研究，所有目標類群都能通過metabarcoding的方法檢測出來，但是類群之間和不同年代的環(huán)境樣品所檢測的結果存在較大變異范圍。

目前國內(nèi)在應用環(huán)境DNA metabarcoding技術研究生物多樣性的報道還比較少。

外來入侵物種監(jiān)測：

目前外來入侵物種的情況日趨嚴重。當外來物種入侵時，入侵物種很有可能破壞原本的生態(tài)平衡，使生態(tài)系統(tǒng)不完善，從而對本地物種的種類和數(shù)量產(chǎn)生影響[24]。但是在早期入侵階段外來入侵物種通常數(shù)量不多，使用傳統(tǒng)的檢測方法耗時且效率不高，難度高，不能及時被發(fā)現(xiàn)。這會導致外來入侵物種對本地生態(tài)平衡的危害達到最高值時才受到重視，為時已晚。環(huán)境DNA metabarcoding增強了對入侵物種早期監(jiān)測的可能性，可以有效地遏制物種入侵。

研究發(fā)現(xiàn)利用環(huán)境DNA metabarcoding可以從淡水中提取環(huán)境DNA，檢測出外來入侵物種的存在。Ficetola等[24]最早將環(huán)境DNA metabarcoding應用于物種監(jiān)測，他們使用特異性引物擴增短線粒體DNA序列追蹤在受控環(huán)境和自然環(huán)境中一種入侵牛蛙(Rana catesbeiana)的存在，發(fā)現(xiàn)對環(huán)境中低密度的物種，使用metabarcoding技術仍然可以進行快速有效的物種檢測。這是結合大規(guī)模測序和DNA條形碼技術的發(fā)展來進行物種識別，為利用環(huán)境DNA監(jiān)測外來物種提供了新方法和新思路。Jerde等[26]利用環(huán)境DNA研究美國芝加哥地區(qū)河流中的兩種入侵亞洲鯉科魚(Hypophthalmichthys molitrix和H.nobilis)，發(fā)現(xiàn)使用傳統(tǒng)電氣捕魚法檢測到一條魚需要93人d的努力，而環(huán)境DNA metabarcoding方法檢測到目標物種只需要0.174人d。在亞洲鯉科魚種群密度很低的區(qū)域，只有環(huán)境DNA方法能夠檢測到這兩種魚[5]?？梢?，環(huán)境DNA metabarcoding方法不僅在時間和資金成本上優(yōu)于傳統(tǒng)監(jiān)測方法，而且可以在種群密度很低的環(huán)境樣本中靈敏地檢測到入侵物種的存在。Piaggio等[23]捕獲入侵佛羅里達州的半水棲物種緬甸巨蟒(Python bivittatus)，放置于90L的水箱中評估水中環(huán)境DNA的降解速率，結果表明緬甸巨蟒的DNA在96h以內(nèi)都可以檢測到。在佛羅里達州6個野外地點采集的水樣中，有5個地點的緬甸巨蟒環(huán)境DNA為陽性，這與緬甸巨蟒的野外分布結果一致。Takahara等[7]使用環(huán)境DNA方法采集日本海岸以及周圍島嶼的70個水樣對一種入侵藍腮太陽魚(Lepomis macrochirus)進行檢測。利用藍腮太陽魚的特異性引物(100bp的Cyt b片段)擴增水環(huán)境DNA，結果表明70個池塘中有19個池塘遭受藍腮太陽魚的入侵。盡管魚的大小、習性等因素對實驗結果有一定影響，但使用環(huán)境DNA metabacoding提高了監(jiān)測入侵物種的準確度。

稀有物種保護：

通過水體中的環(huán)境DNA可以有效檢測水生脊椎動物，并且已在濕地和大型河流研究中得到證實^[26]。利用環(huán)境DNA檢測河流中的稀有物種和隱秘物種可以增加調(diào)查結果準確性，減少調(diào)查成本。Goldberg等^[8]利用metabarcoding技術，通過收集快速流動的水體環(huán)境DNA樣本，對尾突角蟾(Ascaphus montanus)和愛達荷陸巨螈(Dicamptodon aterrimus)兩種物種進行監(jiān)測。設計特異性引物尾突角蟾和愛達荷陸巨螈的線粒體Cyt b區(qū)域的85bp和78bp片段，在5個不同物種密度的水樣中均成功進行了PCR擴增并靈敏地檢測到了目標物種的存在。該研究還發(fā)現(xiàn)早春季節(jié)比早秋季節(jié)更難以檢測到兩棲類物種存在，推測可能是由于早春比早秋溫度更低，降低了生物代謝速率而導致。Foote等^[28]從海水中分離DNA，使用特異性引物擴增線粒體DNA區(qū)域60—80bp的片段檢測水體中是否存在港灣鼠海豚(Phocoena phocoena)，對控制條件下和自然條件下該物種進行遺傳監(jiān)測。在一個樣地中檢測到長肢領航鯨(Globicephala melas)，而該物種極少在研究海域被發(fā)現(xiàn)，結果表明環(huán)境DNA的方法可用于檢測稀有物種。Wilcox等^[27]利用環(huán)境DNA結合定量PCR檢測了河流中的兩個稀有物種，美洲紅點鮭(Salvelinus fontinalis)和強壯紅點鮭(S.confluentus)，同時發(fā)現(xiàn)定量PCR(qPCR)比傳統(tǒng)PCR更加靈敏，檢測概率更高。Rees等^[25]利用環(huán)境DNA和傳統(tǒng)的實地調(diào)查方法開展對英國保護物種冠北螈(Triturus cristatus)的監(jiān)測，野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)有冠北螈分布的地點中，采集的水樣DNA中成功檢測出冠北螈的概率為84%。使用環(huán)境DNA方法監(jiān)測物種，對物種及其生存環(huán)境不會造成損害。隨著測序成本的下降，環(huán)境DNA與metabarcoding技術結合應用在許多情況下甚至優(yōu)于一些傳統(tǒng)監(jiān)測方法，成為物種監(jiān)測方法的又一選擇^[4]。

一些補充說明：

使用環(huán)境DNA監(jiān)測水生生物時，必須保證能獲得該環(huán)境的完整樣品并能進行很好的保存^[27]。水體的溫度和光照情況^[53-54]，水體的流速^[55]，物種密度和在環(huán)境中的停留時間^[54]，生物體的發(fā)育階段^[55]等均會對環(huán)境中所取的DNA的量造成影響。Maruyama等^[56]對水體中DNA的半衰期進行了研究和計算，發(fā)現(xiàn)魚類離開此水體后環(huán)境DNA的半衰期是6.3h，但對環(huán)境DNA降解速率及其影響因素，環(huán)境DNA在環(huán)境中存在時間的長短等問題仍缺乏充分的了解。

在采集溪流水樣時，由于許多溪流水來自于地下水，所以接觸到目標生物脫落DNA的可能性較低。此外，由于溪流水水位淺而且是充分混合的，因此脫落的DNA被光降解的可能性更大，導致在溪流中檢測到的目標物種密度會比較低^[27]。使用環(huán)境DNA metabarcoding技術對淡水中的物種進行檢測已被證實快速有效。淡水中水流較平和且流量小，所以準確度高。與淡水相比，海洋生態(tài)系統(tǒng)中有單位體積中的生物量比例更大，海流和波浪的影響作用，以及鹽度對保存和提取環(huán)境DNA的影響都需要加以考慮。這些因素可能意味著海水中的環(huán)境DNA不太集中，且分散更迅速，提取DNA時比較困難，導致在海水中使用時只能針對一小片區(qū)域，并且對外來入侵物種的檢測效率不高。因此在海水中的使用還需要進一步的研究與完善^[28]。

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