免疫熒光技術(shù)-直接法

1. 標本經(jīng)固定后，PBS洗滌3×3 分鐘；

2. 加熒光素標記的抗體，濕盒內(nèi)37 ℃孵育50 分鐘；

3. PBS洗滌3×3 分鐘；

4. 0.1 %伊文氏蘭復染；

5. PBS洗3 次，蒸餾水洗2 次，每次3 分鐘，以除去NaCl結(jié)晶；

6. 緩沖甘油封片，鏡檢。

對實驗結(jié)果的觀察、判斷與分析是影響實驗結(jié)果的重要環(huán)節(jié)，判斷結(jié)果的好與壞、真與假需注意以下幾點。

1、必須設(shè)立對照染色（陰性或陽性對照），沒有對照染色的結(jié)果是沒有說服力的。

2、正確判斷真陰性和假陽性。

(1)了解抗原表達是否在特定部位，如VP陽性出現(xiàn)在神經(jīng)元胞漿，F(xiàn)os標記細胞胞核，若陽性產(chǎn)物不在抗原所在部位，通常認為是假陽性。

(2)對陰性結(jié)果，不能視為抗原不表達，應該參考他人的結(jié)果或進行相應的對照實驗，尋找原因，判斷是否為真陰性。

(3)在切片破損區(qū)域，出血壞死灶或刀痕等位置容易出現(xiàn)陽性表達，應鑒別分析。

(4)染色時間的掌控很關(guān)鍵，可以避免非特異著色或假陽性細胞。

3.所有免疫組化操作步驟均能影響其結(jié)果，判斷的關(guān)鍵在于以下幾點。

(1)組織切片完整，結(jié)構(gòu)清晰，說明灌注取材、脫水、制片過程中沒有問題。

(2)切片著色鮮艷，說明抗體種屬之間配伍沒有錯誤，染色步驟正常。

(3)陽性與陰性結(jié)果部位明確，說明所用抗體的特異性強。

4.切片例數(shù)、陽性產(chǎn)物數(shù)量統(tǒng)計、分析應符合統(tǒng)計學要求。